不同產(chǎn)地黃連抗內(nèi)毒素活性的研究

陳玉蘭 沈宏萍 邵盛春 蒲清榮 張藝（通訊作者）

（1 西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院 四川 瀘州 646000）

（2 成都中醫(yī)藥大學(xué) 四川 成都 610075）

中藥藥理成分經(jīng)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，認(rèn)為中藥方劑中具有清熱解毒效果的藥物，通常在治療中可起到抗細(xì)菌內(nèi)毒素、解熱、抗炎、抗病原微生物以及增強(qiáng)免疫能力效果[1-3]，中醫(yī)理論視角下，內(nèi)毒素被歸納為“毒邪”，隸屬于“清熱”治療范疇，黃連為解毒瀉火、燥濕清熱藥物，為探究其品質(zhì)，本文通過測(cè)定不同產(chǎn)地黃連體外內(nèi)毒素活性水平，將黃連清熱解毒功能依據(jù)產(chǎn)地劃分，將其內(nèi)在生物學(xué)價(jià)值及功效差異以采取動(dòng)態(tài)比濁法評(píng)價(jià)。

1.實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器與材料

試劑：取規(guī)格為5ml/支、批號(hào)為180908、廠商為湛江安度斯生物有限公司的檢查用水；取規(guī)格為0.1EU/ml、批號(hào)為1805050、廠商為湛江安度斯生物有限公司的鱟試劑；取規(guī)格為10EU/支、批號(hào)為080725、廠家為中國(guó)生物制品檢驗(yàn)所的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品；取批號(hào)為20130011、廠商為上海三浦化工有限公司羧甲基纖維素鈉（羧甲基纖維素鈉）。

儀器：取型號(hào)為WH-2型、廠商為上海滬西分析儀器廠的微型旋渦混合儀；取型號(hào)為DSY-1-4孔、廠商為北京國(guó)華醫(yī)療器械廠的恒溫水浴鍋；取型號(hào)為S·SW-CJ-1F型、廠商為上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠的凈化工作臺(tái)；取型號(hào)為L(zhǎng)DZX-40BI型、廠商為上海申安醫(yī)療器械廠的壓力蒸汽滅菌器；取型號(hào)為BET-32M型、廠商為天津大學(xué)無線電廠的細(xì)菌內(nèi)毒素分析儀；取型號(hào)為101C-2型、廠商為上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司的電熱鼓風(fēng)干燥箱。

1.2 實(shí)驗(yàn)樣品

黃連樣品10批購(gòu)至瀘州寶光醫(yī)藥有限公司，產(chǎn)地分別為四川峨眉、洪雅、彭州、大邑、重慶石柱、湖北利川，鑒定中藥師為蒲清榮主任（西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室），均符合2015年版《中國(guó)藥典》黃連項(xiàng)下規(guī)定。

2.實(shí)驗(yàn)方法

2.1 黃連樣品的制備

各取1.6g不同產(chǎn)地黃連粉，兩次超聲提取，每次溶劑選100mL甲醇，過濾、取渣、揮干、收集。取0.5%羧甲基纖維素鈉溶液溶解殘?jiān)ㄈ葜?0mL，獲取與近似于原生藥材濃度（160mg/mL）黃連原液，后向安瓿瓶轉(zhuǎn)移。以8次梯度稀釋，稀釋濃度分別為 1/21、1/22、1/23、1/24、1/25、1/26、1/27、1/28。另取2mL 5%羧甲基纖維素鈉混懸液，分別加至2個(gè)安瓿瓶，作為對(duì)照管（陽性及陰性），見表。

表 黃連樣品編號(hào)及產(chǎn)地

2.2 高壓滅菌

對(duì)0.5%羧甲基纖維素鈉混懸液、黃連原液安瓿瓶行高壓蒸汽滅菌，設(shè)置溫度、壓力及滅菌時(shí)間（分別為121℃、0.1MPa、0.5h），隨用隨取。

2.3 測(cè)試樣品抗內(nèi)毒素活性

2.3.1 制備內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液 取內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品（10 EU），于15ml檢查用水中稀釋，經(jīng)1/4h充分渦旋混合后，獲得濃度為2 EU/ml，置于滅菌的錐形瓶中。

2.3.2 藥物與內(nèi)毒素反應(yīng) 取玻璃試管，先后加入0.2ml內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液和藥物溶液，封口膜封閉后，持續(xù)2min渦旋混合，后恒溫（37℃）水浴孵育1h。

2.3.3 反應(yīng)及測(cè)定 取定量專用試管，先后加入孵育后液體、鱟試劑，均為0.1ml，封口膜封閉后，凈化工作臺(tái)上混勻后測(cè)定。

2.4 黃連樣品制備方法考察

準(zhǔn)確稱取兩份1.6g黃連粉末（HL-001），分別置錐形瓶、圓底燒瓶中，用100mL甲醇超聲提取2次；以160ml蒸餾水回流，去上清，合并殘?jiān)]干。在羧甲基纖維素鈉中溶解殘?jiān)ㄈ葜?0mL后向安瓿瓶轉(zhuǎn)移，備用[4]。

2.4.1 黃連樣品抗內(nèi)毒素測(cè)定 原液以1/21、1/22、1/23、1/24、1/25獲取藥物濃度（mg/ml）分別為80×20、80×2-1、80×2-2、80×2-3、80×2-4。另取兩個(gè)試管作為對(duì)照管（陰性及陽性），均加0.2mL0.5% 羧甲基纖維素鈉混懸液。

2.4.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與模型對(duì)照管比較中，超聲液21、22、23、24、25倍稀釋與水煎液21、22、23倍稀釋的反應(yīng)時(shí)間明顯延長(zhǎng)（P＜0.01），說明超聲液稀釋21、22、23、24、25倍，水煎液稀釋21、22、23倍內(nèi)毒素活性明顯。

3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在不同產(chǎn)地的黃連甲醇超聲提取物進(jìn)行稀釋，稀釋至1/256，并進(jìn)行體外抗內(nèi)毒素活性研究，數(shù)據(jù)用SPSS 11.5處理，以單因素方差分析進(jìn)行組間差異比較，方差齊，則以LSD檢驗(yàn)，方差不齊則以Tamhane's T2檢驗(yàn)，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義則P＜0.05。結(jié)果顯示13-18號(hào)黃連樣品（產(chǎn)地為峨眉、洪雅）在體外最低抗內(nèi)毒素濃度（0.625mg/ml）時(shí)均具有明顯的體外抗內(nèi)毒素活性，而其它產(chǎn)地的黃連樣品在該稀釋度下有些已無抗內(nèi)毒素活性。

4.討論

結(jié)果表明，不同產(chǎn)地黃連體外抗內(nèi)毒素活性不同，13-18號(hào)黃連樣品（產(chǎn)地為峨眉、洪雅）在體外最低抗內(nèi)毒素濃度（0.625mg/mL）時(shí)均具有明顯的體外抗內(nèi)毒素活性，而其它產(chǎn)地的黃連樣品在該稀釋度下有些已無抗內(nèi)毒素活性。結(jié)果表明，峨眉、洪雅產(chǎn)地的黃連樣品體外抗內(nèi)毒素活性強(qiáng)于其它產(chǎn)地，這與《本草綱目》中記載，雖在蜀皆有黃連，但以眉州、雅州品質(zhì)最佳相符。