魚腥草總黃酮化合物對人肝癌細胞BEL-7402生長的影響分析

徐靜 朱國慶 周義浪 王敏 孫麗娥 蔣梅

（貴州中醫藥大學第二附屬醫院腫瘤科 貴州 貴陽 550003）

魚腥草是一類在東南亞地區或國內南方地區大規模生長的三白草科蕺菜，其主要功效為：清熱解毒、利尿通淋等。有研究者對魚腥草的藥理作用進行研究發現，魚腥草除上述作用外，還有抗菌消炎、抗腫瘤、抗病毒等功效[1]。黃酮類化合物是一類多酚化合物，在多類植物中都廣泛存在，能夠阻礙細胞的增殖，對細胞凋亡產生誘導，同時還可對抑癌基因的活性產生加強作用，并對癌基因的表達產生抑制作用[2]。本研究在研究開始前，對魚腥草總黃酮化合物的成分和含量進行檢測和分析，并在此基礎上圍繞其對人肝癌細胞BEL-7402生長的阻抑作用進行研究，期望對魚腥草的抗癌作用機理進行詳細闡述，為魚腥草在臨床抗腫瘤的實際運用中提供參考。

1.資料與方法

1.1 藥材

本研究于2016年8月在貴陽市百宜鄉和遵義市的新浦區魚腥草種植基地內選取本研究所用的新鮮魚腥草的根和葉。送至貴陽中醫學院藥學院進行鑒定，確定本研究所采取的魚腥草是三白草科蕺菜屬植物蕺菜的新鮮全草。

1.2 試劑與細胞株

本研究使用的試劑有：二甲基亞砜（DMSO）（由江西洪瑞生物技術有限公司提供）、四甲基偶氮唑藍干粉（同上）、碘化丙啶（同上）。AnnexinV-FITC/FITC雙染試劑盒（同上）。蘆丁是本研究自行配制的，其濃度＞98%。AB-8型大孔吸附樹脂由天津南開大學化工廠提供。

人肝癌細胞BEL-7402由武漢大學中國典型培養物保藏中心提供。

1.3 黃酮提取物樣品溶液的配制

對粗提取物進行稱量，將適量的黃酮提取物放入無血清培養基中溶解，配制濃度為6.4g/L的母液，使用規格為0.22μm的濾膜進行過濾，然后將其封存放置于溫度為4℃的環境中留存備用。

1.4 細胞培養

將人肝癌細胞BEL-7402放置在無菌DMEM細胞發育培養液中繼續擰培養，并將其放置在環境溫度為37℃，CO2體積分數為5%的細胞培養箱中進行培養。每隔3天左右的時間對細胞進行一次傳代，選取生長期為對數的細胞作為本研究的樣本細胞。

1.5 魚腥草總黃酮提取物對人肝癌細胞BEL-7402體外增殖的作用研究

運用DMEM培養液，對人肝癌細胞BEL-7402進行稀釋，配制成0.5×108L-1的細胞懸液，并在96孔板上進行接種，各孔均有100μL的培養液和5000個細胞，將其放置在環境溫度為37℃，CO2體積分數為5%的細胞培養箱中進行培養。當細胞完全貼壁后，將濃度為0.1g/L、0.2g/L、0.4g/L、0.8g/L、1.6g/L、3.2g/L、6.4g/L的魚腥草總黃酮化合物分別加入到培養板中，各個濃度水平的藥物均設置了3個復孔，并設置不添加任何藥物的細胞以及添加溶劑的細胞作為對照組，同時還設置調零孔，將其放置在環境溫度為37℃，CO2體積分數為5%的細胞培養箱中進行培養，時間為48小時。

1.6 細胞凋亡的檢測

運用AnnexinV/P I雙染-流式檢測方法，對細胞凋亡的水平進行檢測。在6孔板中，將對數生長期的細胞接種于此，人肝癌細胞BEL-7402的濃度水平是2.5×108L-1，各孔的接種量為2ml，將其放置在環境溫度為37℃，CO2體積分數為5%的細胞培養箱中進行培養。當細胞完全貼壁以后，吸取培養液后放棄，將藥物濃度為0.5g/L、0.8g/L、2.0g/L的無血清DMEM培養液分別加入其中，并設置對照孔，繼續進行培養，時間為48小時。

1.7 統計學方法

2.結果

2.1 魚腥草總黃酮提取物對人肝癌細胞BEL-7402體外增殖的影響

MTT結果顯示，魚腥草總黃酮化合物的濃度為0.1g/L、0.2g/L、0.4g/L、0.8g/L、1.6g/L、3.2g/L、6.4g/L時，會以濃度依賴性的形式，對人肝癌細胞BEL-7402的增殖產生阻抑作用，且魚腥草總黃酮化合物的濃度越大，抑制水平越高。

2.2 魚腥草總黃酮提取物對人肝癌細胞BEL-7402凋亡產生的影響

AnnexinV/P I雙染-流式檢測結果顯示，魚腥草總黃酮化合物發揮藥效后，當濃度為0.5g/L、0.8g/L，且作用48小時后，細胞凋亡的數量在一定程度上升，當濃度達到2.0g/L時，細胞凋亡水平達到最大值，總細胞凋亡水平為89.7%。其中在添加藥物的組中，早期凋亡的細胞水平在一定程度上有所增加。

3.討論

臨床醫學認為，魚腥草能夠清肺化痰，同時還能夠治療白血病、抵抗癌細胞和氧化放映。本研究開展前，曾通過研究發現，在魚腥草中，含有黃酮、生物堿等成分，且發現部分以魚腥草為主要藥材的藥品，如先魚湯、參慈膠囊等，可對肺癌細胞產生阻抑作用，效果十分理想。黃酮類化合物是一類多酚化合物，在多類植物中均可檢測出該物質，其潛在的藥用價值較高，目前臨床研究者熱衷于對其抗腫瘤的作用進行研究。本研究運用魚腥草總黃酮化合物對人肝癌細胞BEL-7402生長的抑制作用進行研究，結果顯示，在人肝癌細胞BEL-7402生長過程中，魚腥草總黃酮提取物可發揮顯著的阻抑作用，依據檢驗結果，設置不同濃度水平的藥物組，運用流式細胞儀，對魚腥草總黃酮化合物對人肝癌細胞BEL-7402生長的影響進行檢驗，結果顯示，在人肝癌細胞BEL-7402的生長過程中，魚腥草總黃酮化合物能夠阻抑作用。

綜上所述，在人肝癌細胞BEL-7402生長中，魚腥草總黃酮提取物可誘導細胞凋亡，抑制細胞增殖。