高通量測序技術在新生兒地中海貧血基因篩查中的應用

羅桂香，李戀湘，周穎娟，李磊

（珠海市婦幼保健院，廣東 珠海 519001）

目前，雖然醫療衛生事業得到了極大的提升，使得多種疾病得到了良好的治療，但依然存在著各類疑難雜癥，其中以先天性疾病最具代表性。地中海貧血便是新生兒先天性缺陷的一種，在該先天缺陷的影響下，使得患兒于剛出生便存在著嚴重的發育不良、貧血、黃疸等臨床癥狀，治療難度大。據相關調查表明，該疾病多發于東南亞各地區，我國較少，主要為兩廣及海南等地。地中海貧血主要是因為新生兒體內因地中海貧血基因的存在而出現嚴重的基因缺陷，對患兒體內本應正常合成的珠蛋白鏈產生影響。由于地中海貧血對新生兒的傷害極大，且治療困難，因此，要秉承著早發現、早預防、早治療的理念，當前，高通量測序技術對地中海貧血基因的篩查準確率較高，且篩查范圍、準確率、便捷性均明顯優于傳統常規篩查法。本文圍繞高通量測序技術在地中海貧血基因篩查中的檢測效能進行了詳細分析。本研究使用下一代測序技術（next generation sequencing technology，NGS）對樣本進行地貧基因檢測，通過生物信息學分析，分析地貧基因點突變和缺失等信息。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本次對照實驗中，地中海貧血陽性者共219例，均為2018年9月-2019年6月期間在我院接受產前檢查的孕婦，入組前，孕婦及其家屬已同意參與本次實驗，并已在相關知情同意書中簽字，研究對象中不存在各類慢性疾病、血液型疾病及精神類病史。219例陽性孕婦中，最小年齡21歲，最大年齡37歲，平均年齡（31.25±2.09）歲。

1.2 方法 用EDTA抗凝管采集研究對象外周血，每人兩管，每管約3 mL，分別用于常規地中海貧血基因檢測和高通量測序地貧基因篩查[1]。

1.2.1 常規篩查 采用跨越斷裂點的PCR（gap-PCR）[2]進行檢測，基因檢測試劑盒（深圳益生堂技術有限公司）進行基因診斷，檢測4種缺失型（-SEA、-α3.7、-α4.2和-αTHAI）α-地中海貧血。采用反向點雜交（RDB）技術[3]，檢測3種非缺失型（HbWS、HbCS、HbQS）地貧和17種（包括-28M、41-42M、654M、14-15M、71/72M、-29M、31M、CAP、32M、17M、43M、27/28M、βEM、IVS1-1M、IVS1-5M、IntM、30M）β-地中海貧血。并由專業人員詳細記錄檢查數據[4-6]。

1.2.2 高通量測序 在樣本采集完畢后將進行儲存，檢查無誤后對樣本進行DNA提取、純化及質量鑒定，然后進行文庫構建和定量檢測。然后采用BGISEQ500測序平臺，采用雙端測序的方式進行基因組測序，然后進行生物信息學分析。

1.3 觀察指標 觀察指標使用兩種檢測方法的陽性檢出率，若檢查結果為陰性，則不計入檢測準確例數中，在檢查完成后，還需要使用Sanger進行驗證。

1.4 統計學處理 實驗過程中，需要對數據進行分析處理，應用SPSS 23.0軟件分析，計數資料以例和百分率表示，行χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

采用高通量測序技術進行檢測，準確檢測出217例，誤診2例，準確率99.08%；而對孕婦實行常規篩查檢測，準確檢出168例，準確率76.71%。由此可見，高通量測序技術的準確率較高，且明顯高于常規篩查，數據間差異具有明顯可比性，研究組基因檢測準確率明顯高于參照組（P＜0.05）。見表1。

表1 兩種地中海貧血基因檢測方式的檢測準確率對比

3 討論

近年來，地中海貧血的發病率在不斷提高，導致人民的生活水平受到了較大的影響。地中海貧血又被稱為珠蛋白生成障礙性貧血或者海洋性貧血，其發病原因多為遺傳所致，新生兒體內存在地中海貧血基因，在該基因的影響下，新生兒的珠蛋白生成出現障礙，給新生兒的生長發育造成了嚴重傷害，若沒有及時發現并給予針對性的防治，極有可能在出現黃疸、發育不良等臨床癥狀[7]。

患有地中海貧血的新生兒因其地中海貧血基因的不同有著較多的臨床表現，但一般主要可以分為輕型、中間型及重型。輕型的地中海貧血，其癥狀極為淺顯，不能通過常規檢查方法準確檢測出，中間型地中海貧血癥狀相對比較嚴重且個體變異度較大。若新生兒的地中海貧血為重型，難免剛出生伊始，其機體便會出現嚴重的病理特征，一般常見癥狀為發育不良、黃疸等，但極有可能會因其地中海貧血基因型的不同而出現頭大、臀狀頭、馬鞍鼻等多種病理情況。患者多采用紅細胞輸注、脾切除、造血干細胞抑制異基因、基因活化治療等多種方法進行治療[8]。

目前常見地中海貧血基因檢測方法主要有常規檢測方法及高通量測序技術，據實際應用結果來看，使用在跨越斷裂點PCR的常規檢測方法能夠涵蓋的地中海貧血基因類型較少，僅能夠檢測出比較常見的α-地中海貧血和β-地中海貧血。且檢測方法的操作相對較繁瑣，因此局限性較大。與常規檢測方法相比，高通量測序技術在檢測范圍、準確率方面有著較大的提升，且一次性最多檢測量高達338例，一度成為地中海貧血基因篩查中最便捷的方法。

在高通量測序技術應用于地中海貧血基因檢測時，可以在擴增檢查樣基因后結合Gap-PCR技術進行雙向檢驗，若樣本DNA中存在缺失型和突變型也能夠準確檢測出，大大提高了檢測準確率，此外，高通量測序技術中，最為重要的時期“高通量”，能夠一次性檢測數量龐大的DNA樣本，同時，該技術早已應用了現代化信息技術、智能化技術及自動化技術，可以通過特定程序自動化操作，與常規檢測方法中的人工操作相比，便捷性、誤診率方面有較大的差異。由于地中海貧血對患兒身體的傷害較大，且治療難度極大，因此應以預防為主，通過使用高通量測序技術來進行產前篩查，效果甚佳。

據本次實驗結果來看，通過對219例孕婦采用高通量測序技術進行檢測，準確檢測出217例，誤診2例，準確率99.08%；而對孕婦實行常規篩查來進行檢測，準確檢測出168例，準確率76.71%。高通量測序技術的檢查準確率明顯高于常規篩查（P＜0.05）。由以上表述來看，對產前孕婦使用高通量測序術進行地中海貧血基因檢測的應用價值高，適宜推廣。