鈣離子對銅綠假單胞菌生物膜形成的影響

田紅彪，王玉霄，王燕，鄭曉拓，張瑞紅，孫麗靜

（保定市第四中心醫院檢驗科，河北 保定 072350）

銅綠假單胞菌作為醫院主要的條件致病菌之一，由于抗菌藥物尤其是廣譜抗生素的不合理使用，導致多重耐藥菌株的產生，使得臨床常用的抗菌藥物治療無效。銅綠假單胞菌的耐藥機制有多方面，生物膜的形成是其重要的耐藥機制之一，因為生物膜的存在，銅綠假單胞菌逃避了免疫監視，使細菌避免暴露在抗菌藥物之下，原本敏感的抗菌藥物在臨床上治療效果差或無效。清除細菌生物膜，讓細菌重新暴露在敏感的抗菌藥物環境之下，抗菌藥物發揮應有的殺菌作用，是我們應該研究的一個方向。

1 材料與方法

1.1 材料 胰蛋白大豆肉湯培養基（TSB，青島高科技工業園海博生物技術有限公司提供），平板計數培養基（杭州百思生物技術有限公司提供）。

1.2 收集臨床分離的10株銅綠假單胞菌菌株，分別制備成菌懸液約0.5麥氏單位。

1.3 制備胰蛋白大豆肉湯培養基，9 mL/支分裝，高壓滅菌備用。

1.4 制備平板計數培養基。

1.5 配制不同濃度的CaCl2溶液，濃度分別為5、15、45 mmol/mL。

1.2 方法

1.2.1 每個菌株取4支試管，分別編號0、1、2、3。

1.2.2 在0-4號試管中依次加入1 mL蒸餾水0、5、15、45 mmol/mL的CaCl2溶液。

1.2.3 吸取菌懸液10 μL分別接種于到上述試管中，放置搖床37 ℃培養。

1.2.4 分別在6、12和24 h經超聲波振蕩，用PBS連續10倍稀釋接種于平板計數培養基35 ℃ 48 h培養，進行菌落計數，計算平均值（表1）。

1.2.5 接種銅綠假單胞菌的胰蛋白大豆肉湯培養基繼續培養至72 h，觀察生物膜的絮狀物顆粒形成情況。

1.2.6 生物膜形成后滴加冰乙酸直至pH接近3.5，觀察生物膜的變化（圖1）。

2 結果

2.1 從表1中可以看出隨著鈣離子濃度的升高銅綠假單胞菌菌落數也隨之增加。

2.2 從圖1中可看到銅綠假單胞菌生物膜絮狀物顆粒隨鈣離子濃度的升高而增大。

2.3 加入EDTA的液體培養基銅綠假單胞菌菌落數和生物膜絮狀物顆粒減少。

2.4 加入冰乙酸后銅綠假單胞菌生物膜絮狀物顆粒并沒有立即完全消失。

3 討論

細菌生物膜是指正常細菌與細胞表面受體結合而黏附，并分泌多糖基質、纖維蛋白、脂蛋白等胞外多糖聚合物，是細菌以非常精細的方式相互黏連所形成的膜樣結構[1]。生物膜的形成是一個動態過程，包括細菌起始黏附、生物膜發展、生物膜擴散和裂解等階段。在細菌黏附階段由于缺乏生物膜的保護，抗菌藥物易于發揮作用，幾乎所有的銅綠假單胞菌都可以形成生物膜，王忠等[2]的研究發現經過72 h左右后銅綠假單胞菌能夠形成穩定的生物膜。臨床治療銅綠假單胞菌引起的感染應當在72 h內采用有效的抗感染治療。細菌生物膜造成的慢性感染給臨床治療帶來了非常棘手的難題。

任何細菌均可形成生物膜，這是細菌的一種本能。具體某一種細菌能否形成生物膜，取決于生存環境，包括營養成分、溫度、滲透壓、pH、陰陽離子濃度等。密度感應系統作為一種信息交流調控機制，在細菌生物膜的形成和成熟中起著重要的作用。生物膜一旦形成，菌體之間彼此聚集促使微菌落形成，這便是菌體逃避機體免疫監視及免被抗生素清除的主要原因[3]。目前認為，高濃度的鈣離子可以穩定和促進細胞外多糖的釋放，增加生物膜結構的聚集性和抑制生物膜的分解的功能[4]。在富含鈣離子培養基中的銅綠假單胞菌生物膜厚度是不含鈣離子培養基的10倍[5]，可見鈣離子是促進生物膜的形成重要因子之一。Banin等[6]發現往培養基中加入EDTA，已形成的銅綠假單胞菌BF會發生降解破裂，促使銅綠假單胞菌從被膜中游離出來，并且EDTA對游離出被膜的細菌有殺滅作用。同時考察加入飽和量的Ba2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+四種離子對EDTA對被膜中的菌的游離效應的阻斷作用，發現只有加入Fe2+后能完全阻斷EDTA的效應，Mg2+、Ca2+只能部分阻斷。目前生物膜常用的物理清除方法主要有機械清除、超聲波、化學清除劑作用機理各不相同，主要包括天然產物、金屬離子如銅離子、表面活性劑和酶等。乙酸等弱有機酸及抗細菌生物膜能力的主要機制在于未解離狀態的算可以自由擴散通過膜的疏水層，破壞膜內微環境的陽離子及陰離子平衡，導致進入細胞內的乙酸開始解離、游離的氫離子逐漸積累，細胞內蛋白降解、膜性結構及DNA結構損壞[7]，研究顯示乙酸確實有清除生物膜的作用。而生物清除主要是通過噬菌體殺死細菌細胞來瓦解生物膜的結構，達到裂解和分散生物膜的目的。臨床治療有細菌生物膜引起的慢性感染，藥敏試驗報告敏感的抗菌藥物往往治療效果差或無效，與銅綠假單胞菌生物膜有關，通過控制細菌生存的微環境，不能形成生物膜，使細菌處在浮游菌狀態，充分暴露在抗菌藥物環境下，避免發生免疫逃逸，才能使敏感的抗菌藥物發揮應有的作用，感染病灶才可徹底治愈。

表1 不同濃度CaCl2和EDTA的TSB菌落計數平均值