加味陽和湯對膝骨關節炎大鼠模型基質金屬蛋白酶調控及軟骨保護作用研究*

★ 夏漢庭 曹端廣 楊佛 李威 王書豪 劉璞 楊文龍 楊鳳云**（.江西中醫藥大學研究生院 南昌 330004；.江西中醫藥大學附屬醫院 南昌 330006）

膝骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA）是多種因素共同作用下導致關節軟骨纖維化、皸裂、潰瘍、脫失，從而導致關節疼痛、畸形、功能障礙等一系列臨床癥狀的關節退行性疾病［1-2］。65 歲以上人群中OA 發生率50%，其中，8.1%為癥狀性KOA，且呈上升趨勢［3-4］。目前西醫除手術治療外無特效治療［5］，非甾體抗炎藥僅可對癥治療且副作用大。關節軟骨細胞凋亡、細胞外基質（extra cellular matrix，ECM）降解所致軟骨退變是KOA病理過程的核心。臨床研究顯示，加味陽和湯能夠改善KOA 癥狀并延緩軟骨退變［6-7］。為進一步探究加味陽和湯的軟骨保護機制，本研究擬觀察加味陽和湯對碘乙酸（mono-iodoacetic acid，MIA）誘導KOA 大鼠模型中軟骨保護作用及對IL-1β途徑的誘導軟骨細胞中基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）與II 型膠原酶（collagen II，Col2a）的調控作用。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 SPF 級雌性SD 大鼠12 只，體重（200±20）g，5 周齡，江西中醫藥大學大學動物實驗科技中心，許可證號：SCXK（贛）2018-003。隨機分組為空白組、模型組、加味陽和湯給藥組。本動物實驗步驟經江西中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準，并符合國家科學技術委員會《實驗動物管理條例》之相關規定。

1.2 藥物及儀器

1.2.1 藥物與試劑 熟地15g、肉桂10g、麻黃10g、鹿角膠10g、木瓜8g、炮姜6g、白芥子10g、雞血藤20g、漢防己10g、甘草3g，購自江西中醫藥大學附屬醫院中藥房，鑒定符合2010 年《中華人民共和國藥典》規定。由江西中醫藥大學中藥固體制劑制造技術國家工程研究中心進行藥品制備。生藥經水煎、超濾濃縮、冷卻、蒸干制為藥粉，每100g生藥得26g 藥粉。分別按100，200，400，800，1000μg/mL 加入含10%胎牛血清DMEM 培養基用于后續實驗。

碘乙酸（麥克林，I811707）、戊巴比妥鈉（Sigma，57-33-0）、RIPA 試劑（Solarbio，R0020），PMSF（Sigma，93482-50ML-F），β-actin 小 鼠 單克 隆 抗 體（abcam，ab8226）、MMP-3 兔 單 克 隆抗體（abcam，ab52915）、MMP-9 兔單克隆抗體（abcam，ab76003），MMP-13 兔多克隆抗體（abcam，ab39012）一抗抗體，Col2a 兔單克隆抗體（abcam，ab188570），HRP 標記兔抗（Proteintech，SA00001-4）及HRP 標記小鼠抗（Proteintech，SA00001-1）二抗抗體，超敏ECL 發光液（Proteintech，B500024），DMEM 低 糖 培 養 基（Solarbio，31600），胎 牛 血清（Gibco，10099-141），0.25%胰 酶-EDTA 溶 液（Solarbio，T1320），II 型膠原酶（Solarbio，C8150），MTT（Solarbio，M8180），蘇 木 素 染 液（Solarbio，G4441），伊紅染液（Solarbio，G1108），番紅O 染液（Solarbio，G2540），固綠染液（Solarbio，G1663）。

1.2.2 儀器 垂直電泳轉印系統（Bio-rad，1658033），凝膠顯像儀（Biorad，ChemiDoc MP），水平搖床（北京市六一儀器廠，WD-9405D），倒置顯微鏡（奧林巴斯，CX31），酶標儀（Tecan，SPARK），離心機（貝克曼，Optima）。

1.3 動物實驗 結合Udo 等［8］已報道的方法，大鼠常規腹腔注射2% 戊巴比妥鈉麻醉，右膝關節備皮，屈曲膝關節，消毒，關節腔注射含有1mg MIA的50μL 生理鹽水溶液，空白組為50μL 生理鹽水，1周1 次，連續4 周。見軟組織明顯腫脹且體表骨性標志不明顯，即造模成功。飼養環境12h 晝夜循環，自由飲食及活動。第5 周起予以藥物干預。加味陽和湯組予以5.32g/kg 加味陽和湯藥粉溶解于3mL 10%DMSO 溶液灌胃，一日一次，連續8 周。空白組及模型組予以同等劑量10%DMSO 溶液。第12 周后，脫頸處死所有大鼠，取右下肢膝關節用于后續實驗。

1.4 細胞實驗

1.4.1 細胞提取及培養 取SPF 級3 周齡SD 大鼠，常規腹腔麻醉后脫頸處死，乙醇浸泡消毒后于超凈臺內取雙膝關節軟骨，PBS 洗3 次，剪碎，加入0.25%胰酶于37℃，5%CO2培養箱內消化1h 后終止消化。加入0.2%膠原酶置于37℃，5%CO2培養箱內消化4h。鏡下見單個游離細胞后終止消化，150 目濾篩濾后移入25cm3培養瓶置于37℃，5%CO2培養箱內培養。匯合度達到80%時傳代。結合文獻方法［9］對第三代軟骨細胞行甲苯胺藍染色法鑒定并進行后續實驗。

1.4.2 MTT 比色法篩選最佳干預條件 第三代軟骨細胞以5×103/孔種植于96 孔板，貼壁后血清饑餓24h，梯度濃度加味陽和湯（100，200，400，800，1000μg/mL）加入血清培養基內分別干預24h，48h 及72h。另設不含細胞的調零孔及不含中藥的對照孔。干預后加入10μL 0.5%MTT 溶液并置于培養箱內孵育4h，吸棄培養基，每孔加入150μL DMSO 溶液，中速搖晃15min。使用酶標儀在570nm 測定吸光度后依據下列公式計算細胞增殖度：（平均觀察孔OD 值-平均調零孔OD 值）/（平均對照孔OD 值-平均調零孔OD 值）×100%。

1.4.3 細胞干預 第三代軟骨細胞按5×106/孔種植于六孔板中，貼壁后即饑餓24h。分為溶媒組，IL-1β 組及梯度濃度加味陽和湯給藥組。給藥組予以梯度濃度加味陽和湯（100，200，400μg/mL）干預24h 后，給藥組及IL-1β 組加入10ng/ml IL-1β誘導12h，收集細胞，進行后續檢測。

1.5 Western Blot 檢測MMP-3、MMP-9、MMP-13

及Col2a 按150μL/孔加入RIPA 溶液，刮取細胞后，超聲3 次，5s/次，孵育30min，4℃ 14000RPM 離心離心20min，取上清。BCA 定量后加入Loading Buffer 煮沸變性，-20℃保存。上樣前4℃離心，取上清上樣至SDS-PAGE 凝膠，電泳，恒流轉膜至PVDF 膜后，5% 脫脂奶粉溶液封閉1h，4℃孵育一抗，室溫孵育二抗，TBST 洗膜4 次后滴加ECL顯影液，顯像。以內參條帶灰度值為標準將目的蛋白灰度值歸一化處理后比較相對趨勢。

1.6 病理切片觀察 大鼠膝關節標本置于4%多聚甲醛中固定72h，流水沖洗過夜，20%EDTA 脫鈣21d 至針刺無阻力，梯度乙醇脫水后二甲苯透明，石蠟包埋，按5μm 切片。常規脫蠟，梯度乙醇復水，水洗。蘇木精-伊紅染色（hematoxylineosin staining，HE）染色切片浸于蘇木精染色液中5min，水洗后浸于伊紅染色液中5min，水洗，透明樹膠封片。番紅O-固綠（safranning O-Fast green）染色切片浸于固綠染液中5min，1%冰醋酸洗15s，番紅O 染液5min，無水乙醇脫水，透明樹膠封片。置于正置顯微鏡下觀察并依據Lee 等［10］報道進行改良Mankin 法評分。

1.7 統計學方法 數據均采用均數±標準差形式表示，采用SPSS 19.0 軟件進行t檢驗及ANOVA分析，P＜0.05 有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 動物實驗過程中無大鼠死亡。空白組大鼠在假造模后注射處稍敏感，抗拒觸摸、按壓注射處，精神、活動、進食情況可。模型組及給藥組均右下肢跛行，站立取食頻次降低，精神不佳，活動減少。造模后可見膝關節軟骨明顯退變、潰瘍、脫失，合并滑膜增厚，與KOA 軟骨退變特點一致，表明造模成功（圖1）。模型組及給藥組均隨干預進程出現不同程度恢復，其中給藥組精神、活動情況改善優于模型組。

圖1 造模組與空白組軟骨退變對比

2.2 軟骨細胞形態特征及染色鑒定

圖2 鏡下觀察軟骨及甲苯胺藍染色結果

原代軟骨細胞24h 左右即可貼壁，可見少量細胞呈多角形或不規則狀緩慢生長，傳代后增殖速度變快原代約需6d 可傳至下一代，隨后每代需3～4d。第四代后逐漸失去軟骨細胞形態特征。甲苯胺藍染色如圖2 所示，細胞核呈深藍，胞漿及間質呈淡藍色，表明提取及培養所得為軟骨細胞且純度較好，可用于后續實驗。

2.3 MTT 比色法篩選最佳干預條件 MTT 結果顯 示，800μg/mL 及1000μg/mL 組 軟 骨 細 胞 增 殖度 在24h，48h 及72h 條 件 下 均 低 于100，200，400μg/mL 組。各濃度組在培養48h 及72h 時，細胞增殖度均低于各自相應濃度組培養24h 的細胞增殖度。且48h 及72h 各濃度組內均出現不同程度軟骨細胞生長抑制（P＜0.05）。因此，800μg/mL 及1000μg/mL 組及48h、72h 的培養時長不適用于后續實驗，故本實驗選取100，200，400μg/mL 加味陽和湯干預軟骨細胞培養24h 為干預條件（圖3）。

圖3 MTT比色法篩選不同濃度加味陽和湯干預軟骨細胞條件

2.4 MMP-3、MMP-9、MMP-13 及Col2a 蛋 白 表達水平比較 IL-1β 組MMP-3、MMP-9、MMP-13及Col2a 表達與空白組均有顯著差異（P＜0.001）。100，200，400μg/mL 加味陽和湯干預后顯示，加味陽和湯干預24h 能降低軟骨細胞內MMP-3、MMP-9及MMP-13表達，提高Col2a蛋白表達。其中，400μg/mL 組相比100μg/mL 及200μg/mL 組干預效果更顯著，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖4，表1）。

圖4 不同濃度加味陽和湯對軟骨細胞MMPs及Col2a表達的影響

表1 各組MMPs及Col2a指標表達情況（，n=3）

表1 各組MMPs及Col2a指標表達情況（，n=3）

注：與空白組相比，&P＜0.05，&P＜0.01，&P＜0.001；與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；與加味陽和湯高劑量組比較，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。

組別 MMP-3 MMP-9 MMP-13 Col2a溶媒組 0.273±0.039 0.272±0.017 0.242±0.149 1.911±0.229模型組 2.127±0.288&&& 2.016±0.217&&& 2.504±0.543&&& 0.338±0.157&&&低劑量組 1.492±0.159**### 1.449±0.167***### 1.557±0.199**## 0.683±0.138##中劑量組 0.711±0.153*** 0.671±0.063*** 0.836±0.39*** 0.832±0.273*#高劑量組 0.475±0.193*** 0.445±0.041*** 0.242±0.186*** 1.337±0.311***

2.5 組織病理觀察 空白組軟骨面顏色鮮亮，平整，軟骨細胞排列有序，無明顯列席，膠原纖維走向齊整，無血管翳，未見波浪狀斷裂；模型組鏡下可見軟骨整體波浪狀斷裂，凹凸不平，各層軟骨均可見軟骨細胞壞死、排列紊亂，裂隙深達至中間層，基質可見沿膠原纖維走向撕裂，鈣化軟骨層纖維樣變、血管翳、潮線增寬。加味陽和湯給藥組軟骨淺表層面基本光滑平整，未見明顯深達中間層裂隙；可見基質層及鈣化軟骨層內有部分軟骨細胞均勻排列，血管翳大多消失（圖5 和表2）。

圖5 加味陽和湯對軟骨面的保護作用

表2 軟骨組織病理切片改良Mankin評分（，n=4）

表2 軟骨組織病理切片改良Mankin評分（，n=4）

注：與空白組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05。

組別 溶媒組 模型組 給藥組結構改變 0.21±0.06 3.93±0.30* 1.72±0.17#軟骨細胞改變 0.22±0.11 2.37±0.39* 1.19±0.21#番紅區改變 0.36±0.10 2.61±0.41* 1.29±0.37#潮線 0.14±0.06 0.67±0.21* 0.33±0.16#總分 0.92±0.14 9.55±1.21* 4.60±0.63#

3 討論

KOA 可歸于中醫學之“骨痹”范疇。《素問·痹論》有云：“痹在骨則重……在于皮則寒。”這一論述高度的概括了痹病的臨床表現。許鴻照教授認為，中老年腎失封藏，腎陽不足。腎陽虛則溫煦失職，不能氣化，陰寒內凝于肢體關節，鼓動血行不利而逐漸成瘀，氣化失司則體內津液內聚為痰濕之邪，三者共成“寒、痰、瘀”實邪為標，實邪一成，不通則痛。故許鴻照教授在清代名方陽和湯的基礎上，配伍舒筋活絡之雞血藤、木瓜、漢防己以治療KOA 收獲滿意效果。方中熟地大補陰血，鹿角膠填精補髓，強筋壯骨；肉桂、炮姜溫陽散寒解，麻黃開腠理以達表；白芥子祛經絡及皮里膜外之痰；雞血藤補血、活血、祛瘀，木瓜祛風除溫，舒筋活絡；漢防已利水消腫，止痛，甘草調和諸藥。全方共奏溫陽通絡之效，故通則不痛矣。前期研究表明，加味陽和湯可延緩KOA 患者軟骨退變［6］。我們推測該效果是由于下調基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）家族這一系列促軟骨細胞外基質降解的關鍵基因的表達而產生的。

軟骨細胞外基質（extracellular matrix，ECM）過度降解與軟骨細胞凋亡形成惡性循環是KOA 病理過程的主要特點。軟骨組織由軟骨細胞及ECM共同組成，軟骨細胞僅占不足10%，其余均為ECM及水。軟骨組織的功能主要由軟骨細胞分泌的ECM 中排列有序的網狀結構提供。研究表明，軟骨細胞主要功能是分泌ECM，同時ECM 又可反饋作用于軟骨細胞，兩者處于動態平衡［11］。ECM 由膠原、非膠原糖蛋白、氨基多糖與蛋白聚糖及彈性蛋白組成。其中，氨基多糖可與甲苯胺藍反應，且與ECM 中氨基多糖含量變化而變化，故可用甲苯胺藍染色鑒定軟骨細胞。研究表明［12］，II 型膠原（collagen II，Col2a）是構成ECM 框架并提供抗壓縮性能的標志性物質，可作為評價軟骨細胞及ECM 完整性的關鍵指標。OA 發展時伴有ECM 中蛋白多糖濃度不斷下降，Col2a 的降解導致網狀結構纖維方向發生改變，也降低了對蛋白多糖的限制作用，共同導致ECM 降解，軟骨逐漸退變，產生KOA 臨床癥狀。

MMPs 是ECM 降解過程中的核心因素。MMPs與纖維蛋白溶酶共同作用下對幾乎所有軟骨ECM中蛋白多糖具有高裂解活性［13-14］。研究顯示，阻斷或降低MMP 家族的表達，可延緩關節軟骨降解［15-16］。MMPs 不同亞型MMP 對各基質成分的降解能力有所差異，這些不同亞型在KOA 過程中即可各自作用，也可相互協作共同降解軟骨［17］。其中較為重要的有是MMP-3、9 及13。MMP-3 除直接降解ECM 外，另可激活MMP-9、MMP-13等酶原產生級聯放大效應，協同作用于ECM［18］。MMP-9 可破壞ECM，暴露抗原，碎裂膠原使得其更易為MMP-3 降解。MMP-3 和MMP-9 相互作用導致膠原網狀結構失去其原有堅固特性，最終致使軟骨退變［19］。MMP-13 在MMPs 中具有對II 型膠原最強的降解能力，在降解ECM 過程中處于關鍵地位。其降解速度是I 型膠原的5 倍，III 型膠原的6 倍［20］。

本實驗結果表明，加味陽和湯可下調軟骨細胞中異常增高的MMP-3、9、13，從而保護細胞外基質并上調Col2a 表達。同時動物實驗病理切片結果表明，加味陽和湯可延緩軟骨組織降解。本實驗進一步證實了MMPs 是軟骨降解的核心因素，并表明加味陽和湯通過下調MMPs 進而發揮軟骨保護作用可能是其作用機制之一。這一發現為臨床運用加味陽和湯治療KOA 提供了理論基礎，但其與上游信號通路的關系仍需進一步探究。