清血八味片對高脂血癥金黃地鼠血脂的影響及其機制

孫夢佳，杜海濤，蘇麗紅，董梅月，于鵬飛，蔣海強

(1.山東中醫(yī)藥大學藥學院，山東 濟南 250355；2.青島優(yōu)撫醫(yī)院，山東 青島 266000；3.內(nèi)蒙古蒙奇藥業(yè)有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 011700；4.山東中醫(yī)藥大學實驗中心，山東 濟南 250355)

高脂血癥 (hyperlipidemia,HLP) 是一種脂質(zhì)代謝異常性疾病,表現(xiàn)為血漿中一種或幾種脂質(zhì)紊亂,包括血漿膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇水平升高或 (和) 高密度脂蛋白膽固醇水平過低[1]。高脂血癥是動脈粥樣硬化和冠心病的主要發(fā)病因素。近年來,隨著我國經(jīng)濟的快速發(fā)展,生活習慣和飲食習慣的改變等多種因素的影響,我國的高脂血癥患者數(shù)量急劇增加[2-3]。臨床治療上采用西藥的療效比較顯著,目前常用于臨床降血脂的西藥有:他汀類、貝特類、膽酸螯合劑、煙酸類等[4]。這些降血脂藥物雖然可以有效、快速地降低血脂,但是長期服用降血脂藥物副作用較多，比如腹脹、腹瀉、肌無力、肌肉溶解等不良反應[5]。因此,本研究意在從傳統(tǒng)制劑清血八味片中發(fā)現(xiàn)其降血脂作用，尋求一種安全、有效、不良反應小的降血脂的方法。

蒙醫(yī)藥是我國醫(yī)藥學重要的組成一部分，其研究越來越受到大家的關(guān)注。清血八味片(蒙名:琪孫黑木拉-8)是常用的蒙醫(yī)藥復方制劑,源自《甘露四部》,該處方是由寒水石、紫草、土木香、人工牛黃、梔子、瞿麥、石膏、甘草8味中藥材組成,具有清訌血藥效作用，可用于治療血可熱頭痛，口渴目赤，中暑等疾病[6]。八味藥材配伍得當,牛黃活血，紫草、梔子、石膏、寒水石等涼血，土木香行氣，瞿麥利水，甘草調(diào)和主要，奏活血涼血、通絡解毒之功,可暢通心腦血管,排泄代謝廢物、毒素等,從而恢復血液循環(huán)系統(tǒng)平衡[7]。本實驗通過高脂飼料喂養(yǎng)金黃地鼠制作高血脂動物模型，以清血八味片不同劑量進行干預，從而從動物模型層面探討該藥的降血脂藥效。

1 材料

1.1 實驗動物 SPF級雄性金黃地鼠72只，體重(110±5)g，購自北京維通利華有限公司，許可證號:SCXK(京)20160011。實驗動物飼養(yǎng)于山東中醫(yī)藥大學實驗動物中心,實驗動物使用許可證號為SYXK(魯)2017-0022,人工光循環(huán)12 h/12 h,溫度為(24±2.0)℃,濕度為55%±5%。動物實驗流程遵循山東中醫(yī)藥大學有關(guān)實驗動物保護和使用的指南,并經(jīng)山東中醫(yī)藥大學實驗動物福利倫理委員會批準。

1.2 藥品與試劑 清血八味片(500 mg/片，內(nèi)蒙古蒙奇藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號：20170706)；阿托伐他汀鈣片(立普妥，20 mg/片，輝瑞制藥有限公司，生產(chǎn)批號：X07611)；總膽固醇檢測試劑盒(批號：2018051601)、甘油三酯檢測試劑盒(批號：2018081001)、高密度脂蛋白膽固醇檢測試劑盒(批號：2018072701)、低密度脂蛋白膽固醇檢測試劑盒(批號：2018080602)，以上試劑盒均由寧波瑞源生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.3 儀器 卓越310全自動生化分析儀(上海科華實驗系統(tǒng)有限公司)；CP225D電子分析天平(德國Sartorius公司)；高速離心機(美國Thermo Fisher Scientific公司)。

1.4 高脂模型飼料 參照保健食品輔助降血脂動物試驗混合型高血脂造模方法[8]， 在維持飼料中添加20.0%蔗糖、15%豬油、1.2%膽固醇、0.2%膽酸鈉,適量的酪蛋白、磷酸氫鈣、石粉等。除了粗脂肪外,模型飼料的水分、粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、粗灰分、鈣、磷、鈣∶磷均達到維持飼料的國家標準。高脂模型飼料和維持飼料均由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供(批號：19043211)。

2 試驗方法

2.1 動物的分組 金黃地鼠72只，適應性飼養(yǎng)7 d,分為正常組(12只)和高脂模型組(60只)。造模后根據(jù)TC水平將高脂造模組60只大鼠隨機分為模型組、陽性對照藥組、清血八味片低劑量組、清血八味片中劑量組、清血八味片高劑量組，每組12只。

2.2 高脂血癥動物模型制備 正常對照組飼喂維持飼料，高脂模型組飼喂高脂模型飼料。每日補充飲水及飼料,保持實驗動物生活環(huán)境干燥、清潔、通風。連續(xù)喂養(yǎng)2周,眼眶靜脈取血,分離血清,置-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?測定血清中Tch、TG、LDL-C水平。

2.3 動物的分組給藥 經(jīng)過查閱相關(guān)實驗動物文獻[9]，根據(jù)臨床劑量折算，確定金黃地鼠給藥劑量為阿托伐他汀鈣片2.31 mg·(kg·d)-1，清血八味片低劑量為175 mg·(kg·d)-1,中劑量為350 mg·(kg·d)-1，高劑量為525 mg·(kg·d)-1。藥物以0.9%氯化鈉溶液超聲溶解,各組均灌胃給藥。正常組和模型組灌胃給予0.9%氯化鈉溶液。

2.4 樣本采集及指標檢測 造模成功后,進行高脂血癥治療實驗,同時分別給藥,同時給予高脂飼料。給藥2周后于眼眶靜脈取血監(jiān)測Tch、TG、HDL-C、LDL-C水平,判斷模型的保持與否并對藥效學進行推斷；第四周腹腔靜脈采血，3 000 rpm離心15 min，取血清測定血脂的Tch、TG、HDL-C、LDL-C水平，觀測清血八味片干預的藥效作用，嚴格按照試劑盒說明書操作。

3 實驗結(jié)果

3.1 高脂血癥模型造模結(jié)果 正常組與高脂模型組隨機選取動物，造模2周后眼眶靜脈取血進行全自動生化分析，檢測結(jié)果如表1，與正常對照組比較,高脂模型組的Tch、TG、LDL-C均顯著升高(P<0.05)，表示高脂血癥造模已成功。

3.2 清血八味片干預2周后血脂指標測定 清血八味片干預2周后，與正常組相比，模型組Tch、TG、LDL-C水平升高(P<0.05)，HDL-C水平降低(P<0.05)。與模型組相比，陽性藥組的TG水平下降(P<0.05)；低劑量組的Tch、TG水平均出現(xiàn)下降的趨勢， HDL-C水平升高(P<0.05)；中劑量組的Tch、TG水平降低(P<0.05)，HDL-C水平升高；高劑量組的Tch、TG水平均出現(xiàn)下降的趨勢， HDL-C水平升高(P<0.05)，具體結(jié)果見表1。

3.3 清血八味片干預4周后血脂指標測定 如表2所示，干預四周后，與正常組相比，模型組Tch、TG、LDL水平升高，HDL-C水平降低，具有顯著性差異(P<0.05)。與模型組相比，陽性藥組，TG水平下降，HDL-C水平升高，具有顯著性差異(P<0.05)；低劑量組Tch、TG、LDL-C水平下降，HDL-C水平升高，具有顯著性差異(P<0.05)；中劑量組Tch、TG、LDL-C水平降低，HDL-C水平升高，具有顯著性差異(P<0.05)；高劑量組Tch、TG、LDL-C水平降低，HDL-C水平升高，具有顯著性差異(P<0.05)。

表1 清血八味片干預兩周后血脂水平結(jié)果

注：與正常組比較，◇P<0.05；與模型組比較，※P<0.05

表2 清血八味片干預四周后血脂水平結(jié)果

注：與正常組比較，◇P<0.05；與模型組比較，※P<0.05

3.4 清血八味片對各組大鼠肝臟質(zhì)量及其肝臟指數(shù)的影響 給藥結(jié)束時,與正常組相比，模型組金黃地鼠的肝臟質(zhì)量及肝臟指數(shù) (肝重/體質(zhì)量) 顯著升高；與模型組相比，陽性藥組的肝臟質(zhì)量及肝臟指數(shù)顯著下降；清血八味片中、高劑量組金黃地鼠的肝臟質(zhì)量及肝臟指數(shù)顯著降低；低劑量組的肝臟質(zhì)量及肝臟指數(shù)出現(xiàn)下降趨勢，但無顯著性差異，見表3。

表3 各組金黃地鼠肝臟質(zhì)量、肝臟指數(shù)比較

注：與正常組比較，◇P<0.05；與模型組比較，※P<0.05

4 結(jié)論與討論

本實驗綜合以上4周后血脂結(jié)果可以看出清血八味片具有降低高脂飼料誘導的高脂血癥金黃地鼠血脂的功效。給藥兩周后，高中低3個劑量組均出現(xiàn)Tch、TG、HDL-C、LDL-C的調(diào)控作用，給藥4周后，調(diào)控趨勢更為明顯。陽性對照藥側(cè)重調(diào)控TG，而清血八味片對總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白均有調(diào)控作用，說明了中藥的整體調(diào)節(jié)作用。清血八味片治療高脂血癥金黃地鼠過程中，陽性藥組死亡1只，低劑量組死亡3只，中劑量組死亡2只，高劑量組死亡2只，根據(jù)原本每組12只的數(shù)據(jù)，說明4周的給藥過程中具有一定的副作用,建議開展長期毒性實驗。

研究高血脂可以選擇的動物模型有許多。靈長類動物的脂代謝生理病理過程最接近人類，但其代價過高，來源有限。嚙齒類動物大鼠小鼠對膽固醇有先天性耐受力，其造模過程比較長，且內(nèi)源性膽固醇合成量與人類的差異較大，并且膽固醇的血漿清除率明顯高于人類，因此動物實驗結(jié)果外推到人體會有一定的限制。內(nèi)源性膽固醇人類合成量1～10 mg·kg-1，而大小鼠每天約合成150 mg·kg-1，超過人類的十倍。它們與人類膽固醇合成雖有較大差異，但是Wistar 大鼠對降脂藥的作用更為敏感，適合降脂血脂藥物的發(fā)現(xiàn)。兔子是食草性動物，易拒絕動物性脂肪飼料。基因缺陷性動物使用成本更高，操作復雜且周期長。相對而言，金黃地鼠膽固醇肝外合成比例約為85%，在膽固醇和代謝方面，以及受體與非受體轉(zhuǎn)運途徑的比例與人類類似，且該模型對食物中脂質(zhì)以及調(diào)節(jié)血脂功效成分的反應更加接近人類，因此血脂研究選用金黃地鼠具有必要性。

清血八味片是以蒙醫(yī)藥理論為基礎研制而成，方中紫草、梔子和瞿麥為清血主藥,紫草味甘、咸、寒,歸心,肝經(jīng),功能清熱涼血,活血,解毒透疹,在《神農(nóng)本草經(jīng)》和《本草綱目》中均有記載[10]。紫草的主要活性成分紫草素及其衍生物具有抑制血小板聚集等作用[11]。梔子中的西紅花苷及其代謝物藏紅花酸明顯具有抑制胰脂酶的活性,進而抑制脂肪和膽固醇的吸收,從而發(fā)揮降血脂功效[12]。牛黃成分之一的牛磺酸可抑制心室肌細胞鈣內(nèi)流,減輕細胞鈣超載,能對抗腎上腺素、地高辛和洋地黃誘發(fā)的心律失常[13]。同時,抑制血管平滑肌細胞增生和內(nèi)膜增厚,抗高血壓和抗動脈粥樣硬化,降低血脂,抑制血小板凝集與血栓形成,保護心肌,抗心力衰竭[14]。石膏的主要成分為CaSO4·2H2O,還含有Fe、Cu、Mg、Al、Ti、Sr等多種微量元素,內(nèi)服經(jīng)胃酸作用,一部分變?yōu)榭扇苄遭}鹽,至腸吸收后可增加血鈣離子濃度,進一步抑制神經(jīng)應激反應、減輕血管通透性,故可以發(fā)揮清熱瀉火、除煩止渴等功效[15]。寒水石的主要成分為CaSO4·2H2O,經(jīng)涼制后失去結(jié)晶水，寒水石具有清熱瀉火、除煩止渴的功效,經(jīng)涼制后可治療血熱病并有活血化瘀的作用[16]。現(xiàn)代藥理研究表明,甘草中含有甘草酸,甘草酸肌內(nèi)注射對實驗性高脂血癥家兔有明顯的降脂作用,可使血漿Tch和TG含量明顯下降,減輕動脈粥樣硬化的程度[7]。本次實驗發(fā)現(xiàn)清血八味片明顯的降血脂作用，尤其是降低Tch、TG、LDL-C，升高HDL-C，應是清血八味片治療訌血癥機理的一部分。