液相色譜法測定肉制品中萬古霉素的殘留量

李琳

（1.天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津300457；2.中國商業聯合會商品質量監督檢驗測試中心（天津），天津300070）

萬古霉素（vancomycin）屬于糖肽類抗生素，被視作抗生素的“最后一道防線”，主要用來治療對所有抗生素都無效的嚴重感染[1]。萬古霉素是一種廣譜抗菌素，具有嚴重的耳毒性及腎毒性，所以只用于短期搶救。

由于畜牧養殖行業越發集中的發展，為了疾病預防的需要[2]，不合理的使用抗生素現象比較普遍。人體長期攝入低劑量的抗生素，會造成抗生素在體內逐漸蓄積進而導致體內多器官發生病變。長期攝入低計量的抗生素也會引起人體內菌群的紊亂和耐藥性，最終可能導致超級細菌的形成[3]。

同時，萬古霉素被列入《食品中可能違法添加的非食用物質和易濫用的食品添加劑名單》[4]中，目前相關部門尚未頒布相應的檢測方法，國外主要采用液相色譜儀-串聯質譜法進行檢測[5-6]。本文建立了高效液相色譜法測定肉制品中萬古霉素殘留量，為工作方法的建立提供了一種思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和儀器

1.1.1 主要試劑

鹽酸萬古霉素標準純品（1404-93-9）：德國Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）：美國 FisherChemical 公司；甲酸（分析純）、乙酸（分析純）：天津市化學試劑五廠分廠；乙酸銨、磷酸二氫鉀（均為分析純）：天津市風船化學試劑科技所有限公司；二氯甲烷、乙醚、石油醚、正己烷（均為分析純）：天津市化學試劑股份公司第二分公司；氨水（分析純）：天津市光復科技發展有限公司；磷酸（分析純）：天津市化學試劑研究所有限公司；PCX-SPE 柱、C18-SPE 柱：天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.1.2 主要儀器

Agilent 1260 液相色譜儀：美國Agilent 公司；AL204 電子分析天平（精確至 0.000 1 g）、FE20 實驗室pH 計（精確至0.01）：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；KQ-300DE 數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；XW-80A 微型旋渦混合儀：上海滬西分析儀器廠有限公司；GL-20G-Ⅱ高速冷凍離心機：上海安亭科學儀器廠；12 管防交叉污染固相萃取裝置：美國SUPELCO 公司；GM-0.50 兩用型隔膜真空泵：天津市騰達過濾器件廠；A10 純水機：MILLIPORE 公司；0.22 μm微孔過濾膜[聚醚砜（poly ether sulphone，PES）]、0.22 μm過濾膜：天津市津騰實驗設備有限公司；一次性無菌注射器：江西洪達醫療器械集團有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品的提取方法

稱取5.00 肉制品，置于離心管中，加入10 mL 0.1%甲酸水-乙腈（體積比為 7 ∶3），漩渦振蕩 1 min，超聲輔助提取 20 min。4 ℃下 8 000 r/min 離心 5 min，將上清液轉移到另一個干凈的離心管中。殘渣再加入5 mL 0.1%甲酸水-乙腈，漩渦振蕩1 min，超聲輔助提取20 min。4 ℃下 8 000 r/min 離心 5 min，合并上清液，加入3 mL 乙腈飽和的二氯甲烷，振蕩混勻。4 ℃下8 000 r/min 離心5 min，棄去二氯甲烷層，再加入2 mL二氯甲烷，振蕩混勻。4 ℃下8 000 r/min 離心5 min，棄去二氯甲烷層，水相層待凈化。

1.2.2 固相萃取柱凈化方法

固相萃取柱經過3 mL 甲醇，3 mL 水活化固相萃取柱，棄去流出液后，以小于1 mL/min 速度將待凈化液通過固相萃取柱，加入1 mL 水，棄去淋洗液，負壓抽干，用8 mL 5%氨化甲醇溶液洗脫，收集流出液，35 ℃氮吹至近干，用1.0 mL 0.1 %甲酸水溶解定容，過0.22 μm 水系膜，待測定使用[7]。

1.2.3 液相條件

色譜柱：Aglient ZORBAX SB-C18 柱，150 mm（柱長）×4.6 mm（內徑），粒徑 5 μm；流速：1.0 mL/min；流動相：20 mmol 乙酸銨（pH 3.2）-乙腈；梯度洗脫：0.00～3.00 min，乙腈體積保持 10%，3.00 min～15.00 min，乙腈體積由10 %增加到90 %，15.00 min～15.01 min，乙腈體積由90 %降低到10 %，15.01 min～20.00 min，乙腈體積保持10%；檢測波長：236 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

1.2.4 不同因素對萬古霉素出峰情況的影響

1）液相色譜體系中流動相的選擇。選擇乙酸銨和磷酸二氫鉀作為水相流動相分別進行色譜分離，分析不同鹽溶液對萬古霉素出峰情況的影響；

2）液相色譜體系中流動相的水相pH 值的選擇。調節水相 pH 值分別為 3.2，5，7，分析鹽溶液不同 pH 值對萬古霉素出峰情況的影響；

3）提取劑的選擇和使用體積，對萬古霉素回收率的影響。稱取5.000 g 的加標肉制品，每份用10 mL 的提取劑進行提取，計算萬古霉素的回收率，測試提取劑對萬古霉素結果的影響；稱取5.000 g 的加標肉制品3 份，第一份添加10 mL 提取劑；第二份添加15 mL提取劑分兩次超聲輔助提取（第一次10 mL，第二次5 mL），第三份添加15 mL 提取劑，測試萬古霉素的回收率，測試提取劑使用體積對萬古霉素結果的影響；

4）對固相萃取過程中的洗脫劑進行選擇和使用體積，對萬古霉素回收率的影響。根據固相萃取柱和萬古霉素的極性，選擇洗脫液分別為5%氨化甲醇[8]、10 %醋酸甲醇[9]、0.1 %甲酸-乙腈（1+9）、乙腈[10]進行比較。

2 結果與分析

2.1 液相條件的優化

流動相中加緩沖鹽是為保持流動相的酸堿度穩定，同時也能使被測物質保持穩定[8]。在已知的高效液相色譜法測定萬古霉素應用中，大部分的研究報道在血藥研究[11-12]和人體細胞組織[13-14]中藥物殘留上。根據文獻報道[15-16]，流動相使用的是0.05 mol/L 磷酸二氫鉀（pH=3.2）-乙腈。由于磷酸鹽容易結晶，導致液相色譜容易磨損或污染，因此本文討論用乙酸銨是否能代替磷酸二氫鉀進行色譜分離。圖1 是流動相不同緩沖鹽下萬古霉素的色譜圖。

圖1 不同緩沖鹽體系的色譜圖Fig.1 Chromatographic charts of different buffer salt systems

由圖1 可以看出，色譜峰對稱性都很好，并且無拖尾現象，因此緩沖鹽對峰形影響的差別很小，但乙酸銨的響應值明顯優于磷酸二氫鉀，因此乙酸銨可以作為流動相中的緩沖鹽使用。

同時測試了50 mmol/L 乙酸銨、20 mmol/L 乙酸銨對萬古霉素出峰情況的影響，結果表明，乙酸銨的濃度對峰形效果的影響不明顯。考慮到分析純試劑對儀器靈敏度可能略有影響，所以最終選擇20 mmol/L 乙酸銨作為緩沖鹽使用。

圖2 是在不同pH 值的流動相下萬古霉素的色譜圖。

由圖2 中可以看出，pH=7、pH=5 時，有拖尾現象并且色譜峰響應值也不高，而pH=3.2 時出峰效果最理想，峰形比較對稱，無拖尾現象，響應值明顯，因此本文流動相緩沖鹽是pH=3.2 的20 mmol/L 乙酸銨。

圖2 不同pH 值緩沖液的色譜圖Fig.2 Chromatographic charts of different pH value buffers

紫外吸收波長的選擇，影響到試驗的靈敏度和穩定性[17]。對萬古霉素進行了全波長掃描，在280 nm 處有特征吸收波長[18]，但根據文獻報道大部分的測試萬古霉素選擇的吸收波長為236 nm[19]。因此本文中，以280 nm 和236 nm 做比較，查看兩種波長下色譜圖的差異，結果表明，吸收波長236 nm 處的吸收強度高于280 nm 處，考慮到乙腈的截止波長是210 nm，乙酸銨的截止波長是230 nm。因此，最終選擇236 nm 作為檢測波長進行試驗。

2.2 液相方法曲線線性

將萬古霉素用 0.1 %甲酸稀釋成 8.5、17、51、85、119、170 μg/mL。用液相色譜儀二極管陣列檢測器進行測定，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制校正曲線，圖3 是萬古霉素在液相色譜中的校準曲線圖。

圖3 萬古霉素液相色譜儀校準曲線Fig.3 Calibration curve of vancomycin liquid chromatography

萬古霉素在液相色譜中的線性方程式是：Y=9.014 62X+0.538 75，線性相關系數 R2=0.999 84，可以看出濃度與響應值線性良好。

2.3 樣品前處理條件的優化

2.3.1 提取劑的選擇和用量

提取方案的選定主要是根據分析物的特性來定。但也需要考慮樣品的組分（如脂肪含量、蛋白質含量等）以及后面的吸附劑性質等因素。要求提取溶劑使分析物能進入溶液中而樣品中其他物質不溶或少量溶于該溶液中。

測試了不同提取劑[甲醇∶水=5∶5[8]、乙腈∶水=5∶5[20]、乙腈∶0.1%甲酸=3∶7[21]、乙腈∶20 mmol/L 乙酸銨=3∶7（以上均為體積比）]對萬古霉素回收率的影響，結果見圖4。

圖4 不同提取劑下萬古霉素回收率Fig.4 The recovery of vancomycin with different extractants

由圖4 可以看出，用乙腈∶0.1%甲酸=3 ∶7 提取回收的效果略優于其他提取劑。因此，本試驗選擇使用乙腈∶0.1%甲酸=3 ∶7 作為提取劑。

對提取劑用量做優化，圖5 為提取劑不同用量對萬古霉素回收率的影響。

圖5 提取劑不同用量和方式下萬古霉素回收率圖Fig.5 Recovery of vancomycin with different dosage and methods of extractant

由圖5 可以看出，用15 mL 分2 次超聲輔助提取回收的效果明顯優于其他提取方式的效果，因此，本試驗選擇15 mL 提取劑分兩次超聲輔助提取（第一次10 mL，第二次5 mL）作為提取條件。

2.3.2 固相萃取柱的選擇

文獻中，固相萃取柱一般選擇主要選擇2 個品種，反向材料和陽離子交換材料。因此，本文選擇了PCXSPE[22]、C18-SPE[23]進行比較，對萬古霉素回收率結果見圖6。

圖6 不同固相萃取柱對樣品中萬古霉素回收率效果圖Fig.6 Effect charts of vancomycin recovery in samples by different solid phase extraction columns

由圖6 可以看出，兩種固相萃取柱對萬古霉素吸附的效果相近，PCX-SPE 為固相萃取柱時萬古霉素的回收率略高。

2.3.3 洗脫劑的選擇和用量

圖7 是不同洗脫液回收率的試驗結果比較。

圖7 不同洗脫液回收率Fig.7 Recovery of different eluents

結果表明，5%氨化甲醇洗脫液對回收率結果的影響明顯優于其他洗脫液的效果，因此，本試驗選擇5%氨化甲醇作為洗脫液。

對于洗脫液用量的優化，以5 mL 為基礎，增加洗脫液用量，試驗結果表明8 mL 洗脫液可以比較完全的洗下目標物質，并且雜質干擾比較少。

2.4 方法驗證

2.4.1 檢出限和定量限的確定

按照方法配制標準溶液，并按照試驗步驟進行操作凈化空白樣品，用空白樣品不斷稀釋標準品，根據信噪比得到的濃度，計算出檢出限和定量限。檢出限是指由基質空白所產生的儀器背景信號的3 倍值的所對應的物質濃度，經過測量計算檢出限（S/N=3）為0.5 mg/kg。定量限是指由基質空白所產生的儀器背景信號的10 倍值的所對應的物質濃度，經過測量計算定量限（S/N=10）為 8 mg/kg。

2.4.2 加標回收率測定、精密度驗證

由于市面上沒有銷售已知濃度的標準樣品，所以采用空白樣品添加不同濃度待測物質制成有確定含量的樣品，按照操作步驟進行測試。本文進行3 個水平的回收率試驗，分別添加 30、80、150 μg/mL3 種不同濃度，加標回收率結果見表1。

表1 空白樣品加標回收率Table 1 Recovery rate of blank sample

經過計算，3 個添加水平的相對標準偏差分別為：6.67%、3.63%、4.20%，相對標準偏差在10%以內，符合有機物檢測的回收率水平要求。

2.5 試驗方法的應用

利用本試驗已經建立的方法對市場上銷售的肉制品進行檢測，隨機選擇5 個不同品牌的不同類型肉制品（包括老火腿、臘腸、粉腸、午餐肉、蒜腸）進行檢測，均為未檢出萬古霉素殘留。

3 結論

本文建立了液相色譜法測定肉產品中萬古霉素含量。線性范圍是 8.5 μg/mL 到 170 μg/mL，方法檢出限為0.5 mg/kg，定量限為8 mg/kg。添加回收率在75%～95%，精密度為5%～8%。

應用本試驗方法對市場上銷售的5 種肉制品進行測試，結果表明5 個產品均未檢出萬古霉素殘留。為肉制品中萬古霉素含量的測定提供了一個研究思路。