濃香型白酒發酵旺盛期糟醅中酵母菌菌群研究

譚壹，趙東，陳敏，游玲，王濤，*

（1.西華大學食品與生物工程學院，四川成都610039；2.宜賓學院固態發酵資源利用四川省重點實驗室，四川宜賓644007）

在濃香型白酒釀造過程中酵母菌群是一類至關重要的功能微生物[1]，具有影響產酒量、改善產品風味[2]及產生多種活性物質[3]以及能與細菌、霉菌相互作用影響白酒釀造的微生態[4]等多種功能。目前，已經發現的在濃香型白酒釀造過程中的酵母菌有：Wickerhamomyces[5]、Lodderomyces[6]、Clavispora、Issatchenkia、Trichosporon、Saccharomyces[7]、Saccharomycopsis、Zygosaccharomyces、Rhodotorula[8]、Torulopsis[9]、Candida[9]、Hansenula[9-10]、Kluyveromyces[10]、Schizosaccharomyces、Citeromyces[11]、Neatpspora、Brettanomyces[12]、Pachysolen、Porobolomyces、Trulaspora、Dekkera[13]、Geotrichum[14]、Debaryomyces[15]、Malamade、Oosporidium[16]、Torulaspora[17]、Yarrowia[18]、Pichia[19]、Cryptococcus[20]、Naumovozyma[21]、Sporidiobolus[22]31 個屬的酵母菌，其中有16 個屬的酵母菌株尚未獲得純培養菌株，表明在濃香型白酒釀造中尚有多數種屬的酵母菌株資源有待挖掘利用。

宜賓作為濃香型白酒的核心產區，其酵母菌株資源的開發利用也日益受到重視，本研究采用高通量測序及純培養相結合的方法，研究本產區代表企業五糧液發酵旺盛期糟醅中的酵母群體，一方面初步解析濃香型白酒主發酵過程中的關鍵酵母種屬，另一方面初步建立基于培養組學思想的白酒糟醅酵母菌株資源挖掘方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

五糧液發酵旺盛期糟醅：宜賓五糧液技術中心；賴氨酸瓊脂培養、YPD 瓊脂培養基、WL 瓊脂培養基、低真菌pH 瓊脂培養基、孟加拉紅瓊脂培養基及麥芽汁瓊脂培養基（均添加60 g/mL 鏈霉素）[23]：海博公司；DL-乳酸（分析純）：鹽城華德生物工程有限公司；FastDNA SPIN 試劑盒：上海前塵生物科技有限公司；Yeast DNA 試劑盒：上海易匯生物科技有限公司；PCR擴增試劑盒、引物NL-1 5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'、NL-4 5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設備

高壓蒸汽滅菌鍋（MLS-3781L-PC）：上海圳寶機電設備有限公司；生化培養箱（SPX-250B）：上海圣科儀器設備有限公司；超凈工作臺（SW-CJ-2FD）：鄭州宏朗儀器設備有限公司；FastPrep-24TM：上海溪拓科學儀器有限公司；小型臺式冷凍離心機（5418R）：常州諾基儀器有限公司；Themal Cycler PCR 儀（T-100）：上海珂淮儀器有限公司；電泳儀（DYY-12）：北京新諾立華儀器有限公司；藍光透射儀（OSE-470）：天根生化（北京）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 取樣

采用專用取樣器對五糧液發酵窖池中旺盛期糟醅進行多點均勻取樣，以取樣器插入窖池10 cm 處為上層糟醅，2.7 m 處為下層糟醅。取樣時分別于窖池內上下層糟醅同一表面的中心及四周共10 個取樣點，每個取樣點取100 g 的樣品，然后將樣品分別裝入無菌取樣袋中，不冷藏，在1 h 內完成總DNA 提取及純菌分離。

1.3.2 總DNA 提取及高通量測序

按照FastDNA SPIN 試劑盒的方法提取上、下層新鮮酒糟的總DNA，以NL1、NL4 為引物，PCR 擴增酵母26S rDNA 特征序列[24]，獲得聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）產物，并回收純化，利用 Illumina MiSeq PE300 平臺進行高通量測序。

1.3.3 菌株分離純化

按文獻[25]對糟醅混合樣品進行稀釋涂布。在同種培養基上挑選顏色或形態不同的單菌落到相應的培養基的平板上進行劃線純化培養，待其長出單菌落后進行后期菌落及細胞形態觀察合并以及做斜面保藏和30%甘油管保藏在4 ℃冰箱中。

1.3.4 特征序列鑒定

按照E.Z.N.A Yeast DNA 試劑盒的步驟提取純培養酵母菌株的DNA。以NL1、NL4 為引物擴增酵母菌株26S rDNA 序列。

按照即用PCR 擴增試劑盒在無菌潔凈的PCR 管中依次加入：無菌 ddH2O22 μL，2×HiFi-PCR Master 25 μL，DNA 模板 1 μL，引物（10 μmol/L）各 1 μL，終體積 50 μL，離心混勻。

擴增條件：95 ℃預變性 5 min；94 ℃變性 1 min；65 ℃退火1 min：每一個循環溫度降低0.5 ℃；72 ℃延伸 1 min；循環 20 次；94 ℃變性 1 min；55 ℃退火 1 min；72 ℃延伸 1 min；循環 10 次；4 ℃保存。PCR 完后制備1%的瓊脂對產物進行鑒定，觀察是否有條帶，且條帶是否在500 bp～600 bp 之間。再將PCR 產物保存好，最后送到上海生物工程技術服務有限公司完成測序。

將測序后的26S rDNA 序列與NCBI 中模式菌株的核酸序列進行同源序列搜索（Blast Search），同時，運用CLUSTAL W 軟件比對所有近似物種，使用MEGA 6.0 對序列進行同源性分析，采用鄰近連接法（Neghbor-joining）構建系統發育圖，確定其系統發育關系的分類地位[26]。

2 結果與分析

2.1 發酵旺盛期糟醅中的酵母區系解析

選擇五糧液發酵旺盛期糟醅的上下層為研究對象，進行高通量測序獲得五糧液發酵旺盛期糟醅上下層的酵母種屬以及相應的豐度（序列條數reads），結果見表1。

由表1 可以看出，在五糧液發酵旺盛期糟醅中共檢測出9 個屬11 個種的酵母菌群，其中，豐度較高的種屬（優勢種屬）包括Kazachstania exigua（82.97 %）、Saccharomyces cerevisiae（7.89%）、Kazachstania humilis（4.27%）、Pichia kudriavzevii（3.30%）4 個種屬，可以看出Kazachstania 酵母是糟醅中的絕對優勢種屬，其可能是五糧液濃香型白酒發酵旺盛期中的主要功能酵母。上述5 個種之外的其他種屬酵母豐度均較低，其合計豐度不到2 %，這些酵母主要是Zygosaccharomyces bailii、Saccharomycopsis fibuligera、Trichosporon ovoides、Debaryomyces hansenii、Naumovozyma castellii、Pichia manshurica、Geotrichum silvicola 7 個種。

表1 發酵旺盛期糟醅中的酵母區系Table 1 Yeast flora in fermented grains at the main stage of fermentation

從酵母群體的空間分布來看，上層糟醅有9 個種屬的酵母，下層糟醅有11 個種屬的酵母，上層糟醅酵母種屬的多樣性少于下層糟醅的。其中下層糟醅比上層 糟 醅 多 了 Zygosaccharomyces bailii、Debaryomyces hansenii 這2 個種屬的酵母，這可能是由于下層糟醅中的含氧量較低、pH 值較低、溫度較高等正好適合這2種酵母種屬的生長。總體上發酵旺盛期上、下層糟醅中的酵母區系構成基本一致，但是同一口窖池不同層次糟醅的酵母群體之間還是存在著一定的差異性。

2.2 純培養酵母菌株的26S DNA序列鑒定

在7 種培養基上獲得的純培養酵母菌株，將在同種培養基上菌落形態及細胞形態都相同的純培養菌株進行合并，最后這7 種培養基共剩余57 株純培養酵母菌株，再對菌株的26S rDNA 序列進行測序，最后對測序結果獲得的26S DNA 序列進行同源序列搜索后，運用CLUSTAL W 軟件比對以及使用MEGA 6.0 進行同源性分析后采用鄰近連接法（Neghbor-joining）1000次重復自展構建系統發育圖，見圖1。

圖1 純培養酵母菌株的系統發育分析Fig.1 Phylogenetic analysis of yeast isolates based on 26S rDNA sequence

從圖1 可以看出，從五糧液發酵旺盛期糟醅中分離到的酵母純培養菌株共有57 株，分屬于3 個屬4個種，是 Pichia kudriavzevii、Saccharomyces cerevisiae、Candidaglabrata 和Candidarugosa，分別占總純培養酵母菌株的 58.9 %、21.4 %、1.8 %、17.9 %，其中 Candida glabrata 在其他濃香型白酒中并沒有分離到，這可能是五糧液濃香型白酒中特有的酵母菌株。同時，聚在同一分支上的酵母菌株的26SrDNA 序列盡管幾乎完全一致，但其菌株的菌落、細胞形態或氣味等方面仍存在不同程度的差異，表明濃香型白酒發酵旺盛期糟醅中的酵母菌株具有明顯的種內分化現象，但那些與濃香型白酒釀造密切相關的表觀特征（如氣味）與特征序列的關聯并不明確，因此實際工作中，僅依靠特征序列分析從濃香型白酒糟醅中篩選得到具有優良釀造特性的酵母菌株存在較大困難。

2.3 純培養方法與免培養方法比較

將高通量測序獲得的五糧液發酵旺盛期糟醅酵母群體與在7 種培養基上分離到的57 株純酵母菌株經過26Sr DNA 測序后，與NCBI 上的模式菌株比對后獲得的相似性大于99%的種進行比對，結果見表2。

表2 純培養酵母種屬與高通量種屬比較Table 2 Comparison of pure cultured yeast species and highthroughput species

由表2 可以看出，濃香型白酒發酵旺盛期糟醅中的酵母包括 Zygosaccharomyces bailii、Kazachstania exigua、Geotrichum silvicola、Pichia kudriavzevii、Kazachstania exigua humilis 等9 個屬13 個種，高通量測序可檢測到除Candida glabrata 和 Candida rugosa 外的 11 個種，純培養法僅分離到 Pichia kudriavzevi、Saccharomyces cerevisiae、Candida glabrata 和 Candida rugosa 4個種，有 80%的酵母種屬沒有被分離出來，表明高通量測序用于檢測濃香型白酒發酵旺盛期糟醅中的酵母群體明顯好于純培養法，這可能主要是由于發酵旺盛期糟醅中優勢酵母的生長干擾了非優勢酵母的分離，針對這一問題，后續可在高通量測序結果的指導下，充分利用營養及培養條件的組合，設計培養組學方法，分離糟醅中的非優勢酵母。一方面可設計選擇性更強的培養基來抑制優勢種屬酵母菌的生長，分離目的種屬酵母，如設計以木糖作為唯一碳源并耐高滲透壓的培養基分離高度耐鹽的Debaryomyces 屬酵母[27]；利用高滲透壓高酸培養基、并在較高溫度下培養，分離耐鹽、耐酸及耐高溫（可在 40 ℃～50 ℃下生長）的 Kazachstania 屬酵母[28]；設計耐酸培養基分離可耐受pH2.0 的Zygosaccharomyces 屬酵母[29]；設計以木糖為唯一碳源且可耐受 pH 7.0 的培養基分離 Trichosporon 屬酵母[30]，設計耐堿的培養基并在較低溫度下培養，分離耐堿（pH 11.0）及耐低溫（6 ℃）的 Geotrichum 屬酵母[31]。另一方面，針對某些特殊營養需求的酵母，也可通過添加糟醅提取物來滿足其營養需求。

3 討論

同時利用高通量測序技術與純培養方法解析濃香型白酒發酵旺盛期糟醅中的酵母群體，發現濃香型白酒發酵旺盛期糟醅中的酵母包括Zygosaccharomyces bailii、Saccharomycopsis fibuligera、Trichosporon ovoides、Debaryomyces hansenii、Naumovozyma castellii、Pichia manshurica、Kazachstania exigua、Geotrichum silvicola、Pichia kudriavzevii、Saccharomyces cerevisiae、Candida humilis 等 13 個種屬，且 Kazachstania exigua、Pichia kudriavzevii、Saccharomyces cerevisiae、Candida humilis 為優勢種。在醬香型白酒釀造過程中Zygosaccharomyces bailii、Saccharomyces cerevisiae 及 Schizosaccharomyce spombe 為優勢種屬[32]；在清香型白酒釀造過程中 Saccharomycopsis fibuligera、Pichia anomala及Saccharomyces cerevisiae 為優勢種屬[33]，通過對濃香型白酒與醬香型、清香型白酒釀造過程中的優勢酵母種屬的比較，發現不同香型的白酒在釀造過程中的優勢種屬之間存在著一定的差別，而這些差別的優勢酵母群體可能在白酒風味形成過程中有重要的貢獻，后續還需利用分離到的純培養菌株，通過單獨或混合發酵試驗來進一揭示其各種屬的不同代謝特征。

另外，盡管使用了7 種各具特色的培養基來分離五糧液發酵旺盛期糟醅中的酵母菌株，獲得了57 株形態各不相同的純培養酵母菌株，但分離到的酵母種屬也遠遠少于高通量測序檢測到的種屬，一方面說明純培養法仍存在較大局限，需要在高通量測序結果的指導下進一步優化培養組學方法，另一方面，高通量測序結果無法反映種內的酵母形態及釀造特性多樣性，需要通過分離大量純培養菌株開展進一步研究。