殼聚糖明膠可食用復合膜的制備與抗菌性能研究

張立挺，蔣子文，高磊，徐曉娟，王宏鵬，黃俊

（浙江科技學院浙江省廢棄生物質循環利用與生態處理技術重點實驗室，浙江省農產品化學與生物加工技術重點實驗室，浙江杭州310023）

我國的塑料制品自2010 年～2017 年持續增長，2017 年更是達到了7515.5 萬噸，位居世界第一[1]。塑料雖然在過去幾十年給世界帶來方便，但其難降解的問題一直存在。目前城市垃圾中的塑料主要采用焚燒法處理，這樣做最直接的結果是污染大氣。在食品行業中，塑料的應用范圍更是廣泛。近年來隨著經濟的發展，人們對食品品質提出了更高的要求，但也對包裝的材料提出更環保的要求[2-3]。面對日益嚴重的資源枯竭、環境污染以及食品安全問題，人們開始把目光轉向綠色安全的生物可降解材料[4-5]。可食膜是指以天然的可食性物質例如多糖、蛋白質等作為原料，加入一些可食性增塑劑，通過不同分子之間的相互作用產生的薄膜[6]。與傳統塑料包裝材料相比，它能夠更好防止水和油脂擴散到食物表面，同時還可以選擇性的進行氣體交換[7-8]。最重要的是，它對環境沒有污染，可以與食物一起被食用。即便被丟棄也可以自然降解，非常環保。

殼聚糖是自然界中的僅次于纖維素的第二大堿性生物多糖，具有良好的成膜性、抗菌性，生物相容性和生物可降解性[9]。同時明膠作為一種蛋白質，它的吸水性強，水溶液黏度高，生物安全性高，在食品和醫藥等行業具有良好的應用前景[10]。因此，本研究以殼聚糖和明膠為成膜材料，加入一定量甘油作為增塑劑制備可食用復合膜，主要通過析因設計優化成膜工藝，并對優化后的可食用復合膜進行表征和抗菌性能測試。

1 材料與方法

1.1 材料

殼聚糖（脫乙酰度≥95%）、牛肉浸膏、生物試劑：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；瓊脂粉（生化試劑）、明膠（化學純）：國藥集團化學試劑有限公司；甘油（分子生物級）：生工生物工程（上海）股份有限公司；冰乙酸（分析純）：上海展云化工有限公司；氯化鈉（分析純）：廣東光華科技股份有限公司；蛋白胨：杭州微生物試劑有限公司。大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）：由浙江科技學院微生物實驗室保存并提供。

1.2 方法

1.2.1 膜的制備

稱取適當質量的殼聚糖，溶于1%的乙酸溶液中，在30 ℃下磁力攪拌使其溶解。同時配制適當濃度的明膠溶液，在55 ℃～60 ℃下水浴加熱使其溶解。參考王麗媛等的研究結果[11]，將殼聚糖溶液與明膠溶液按6 ∶4（體積比）混合，并加入0.3%的甘油作為增塑劑，在30 ℃下磁力攪拌20 min，然后超聲脫氣30 min 備用。殼聚糖與明膠的單因素試驗按以下方案進行：

1）殼聚糖濃度分別為 0.75%、1%、1.25%、1.5%、1.75%，乙酸溶液1%，明膠1.5%，甘油0.3%；

2）明膠濃度分別為 0.75 %、1 %、1.25 %、1.5%、1.75%，乙酸溶液1%，殼聚糖1%，甘油0.3%。

用50 mL 量筒量取50 mL 膜液倒在底面光滑、平整的培養皿（直徑約為9 cm）中，置于60 ℃的干燥箱中干燥24 h。干燥完畢將培養皿置于室溫（22 ℃）下過夜，然后揭膜并將膜樣置于硅膠干燥器中平衡2 d 后備用。

1.2.2 析因設計

參照食品包裝材料的要求，以較高的抗拉強度與斷裂伸長率和較小的水蒸氣透過系數為參考指標，對成膜性能較好的幾個濃度進行進一步析因優化設計，如表1 所示。

表1 析因設計試驗表Table 1 Factorial design experiment

1.2.3 機械性能測試

根據GB/T 13022-1991《塑料-薄膜拉伸性能試驗方法》。測試前將膜樣裁成20 mm×50 mm 的規格，固定在試驗機夾具上，拉伸速度設定為60 mm/min，測定復合膜的抗拉強度（TS）和斷裂伸長率（E）。每個水平樣品至少測試3 組。

1.2.4 水蒸氣透過系數（water vapour permeability，WVP）測試

根據美國試驗材料學會標準E96-05[12]，測試復合膜的水蒸氣透過系數。用膜將盛有10 mL 去離子水（100%相對濕度，22 ℃）的玻璃稱量瓶（規格25 mm×40 mm，瓶口內直徑35 mm）口封?。▽嶋H操作時為保證有效面積的準確性，用封口膜將瓶口外側的膜密封），然后將稱量瓶置于硅膠干燥器（試驗時將硅膠干燥器置于22 ℃生化培養箱中，以保證測試溫度的穩定）中平衡1 h，稱重。之后每2 h 稱一次，共稱5 次。

1.2.5 X 射線衍射測試（X-ray diffraction，XRD）

將殼聚糖膜、明膠膜和復合膜裁剪成合適大小，小心貼合在測試用玻璃片上進行X 射線衍射。測試電壓為 40 kV，電流為 40 mA，模式為 2θ/θ，掃描角度為5°～50°。測試結束作圖并分析。

1.2.6 掃描電鏡測試（scanning electron microscope，SEM）

將殼聚糖膜、明膠膜和復合膜裁剪成合適大小，分別取3 種膜的水平表面和橫斷面固定在樣品臺上，噴金1.25 min。處理結束將待測樣品置于電鏡中，按要求測試，調整電鏡放大倍數，選取3 種膜的表面和橫斷面電鏡圖保存并分析。

1.2.7 抗菌性能測試

1.2.7.1 培養基的配置

牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂 15 g～20 g，去離子水 1 000 mL，pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌 20 min。

1.2.7.2 菌種的活化

將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌接到牛肉膏蛋白胨培養基斜面，于37 ℃下培養24 h。將活化好的斜面每支加入5 mL 已滅菌的去離子水，洗出菌并混勻。用移液槍取10 μL 菌懸液加到對應培養皿中，涂布均勻。然后在每個培養皿上均勻放上3 個牛津杯（使用前在超凈臺中紫外殺菌），輕輕按壓使牛津杯與培養基表面無空隙接觸，然后在每個牛津杯中加入200 μL 膜液。將培養皿在37 ℃下培養適宜時間，觀察抑菌圈大小，用千分尺測出抑菌圈直徑，以評價其抗菌性能。

1.3 數據處理

每組試驗設置3 個平行，采用SPSS16.0 對數據進行LSD 分析，并利用Oringin 8.0 進行作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

殼聚糖/明膠濃度對復合膜的機械性能與水蒸氣透過系數的影響見圖1。

圖1 殼聚糖/明膠濃度對復合膜的機械性能與水蒸氣透過系數的影響Fig.1 Effect of chitosan/gelatin concentration on mechanical property and water vapor permeability of the composite films

單因素試驗發現，1.75%水平的殼聚糖膜在烘干后玻璃化嚴重，而明膠0.75%水平的復合膜則過于柔軟，均不能撕下完整的膜。對剩余4 個較好成膜水平的膜性能進行考察，如圖1A 所示，在控制明膠濃度為1.5%時，隨著殼聚糖含量的增加，復合膜的抗拉強度逐漸增大，在殼聚糖濃度為1.5 %時，抗拉強度為15.21 MPa。而復合膜的斷裂伸長率上升趨勢不顯著，當殼聚糖濃度為1%時最大，為110.31%，而后略有下降。圖1B 表明，在殼聚糖濃度低于1.25%的范圍內，復合膜的水蒸氣透過系數隨殼聚糖含量的增加而下降，約為 0.59 mg·mm·kPa-1·h-1·m-2。而高于 1.25%時，水蒸氣透過系數略微回升。控制殼聚糖濃度為1%，調整明膠的濃度，考察明膠濃度對復合膜機械性能和水蒸氣透過系數的影響。圖1C、1D 結果表明，隨著明膠濃度的增加，復合膜的抗拉強度和斷裂伸長率均呈上升趨勢。當明膠濃度為1.75%時，抗拉強度和斷裂伸長率達到最大，分別為11.09 MPa 和113.56%。而復合膜的水蒸氣透過系數先下降后上升，在明膠濃度為1.25%時達到最小，其值為 0.56 mg·mm·kPa-1·h-1·m-2。殼聚糖與明膠濃度增加后，自身攜帶的羧基和羥基與明膠分子之間氫鍵及共價鍵作用強度增加，微觀表現為復合膜內分子排列緊密，分子間作用力增強[13]。宏觀表現為復合膜的機械性能增加，即抗拉強度和斷裂伸長率增加，水蒸氣透過系數減小。然而，進一步提高殼聚糖或明膠濃度，又會使水蒸氣透過系數出現反彈。因此，選擇殼聚糖濃度為1%～1.5%，明膠濃度1.25%～1.75%進行進一步析因優化設計，以其獲得性能最優化復合膜制備工藝。

析因設計結果及析因設計結果分析見表2 和表3。

表2 析因設計結果Table 2 The results of the factorial design

根據表2、表3 可知，明膠濃度對復合膜的水蒸氣透過系數影響最大，最大極差為0.177。最優組合為A2B1，即殼聚糖濃度1.25%，明膠濃度1.25%。其水蒸氣透過系數為 0.563 5 mg·mm·kPa-1·h-1·m-2，抗拉強度為12.64 MPa，斷裂伸長率為119.44%。以抗拉強度為考察指標，殼聚糖濃度對復合膜的抗拉強度影響最大，最大極差為3.88。最優組合為A3B2，即殼聚糖濃度1.5%，明膠1.5%。其水蒸氣透過系數為0.849 2 mg·mm·kPa-1·h-1·m-2，抗拉強度為 15.21 MPa，斷裂伸長率為109.16%。以斷裂伸長率為考察指標，殼聚糖濃度對復合膜斷裂伸長率的影響最大，最大極差為12.1。最優組合為A3B3，即殼聚糖濃度1.5%，明膠濃度1.75%。其水蒸氣透過系數為 0.507 mg·mm·kPa-1·h-1·m-2，抗拉強度為14.98 MPa，斷裂伸長率為133.22%。綜上所述，考慮到食品包裝材料的要求，選擇水蒸氣透過系數最低、抗拉強度較大、斷裂伸長率適中的組分，確定最佳膜的組合為：殼聚糖濃度1.5 %，明膠濃度1.25%。由該組合制備的復合膜的水蒸氣透過系數為0.403 mg·mm·kPa-1·h-1·m-2，抗拉強度為 13.24 MPa，斷裂伸長率為112.45%。該復合膜與現有報道的殼聚糖-明膠、殼聚糖-海藻酸鈉、殼聚糖-羧甲基纖維素復合膜的抗拉強度與斷裂伸長率相當，但水蒸氣透過系數至少低1 個數量級，該指標性能顯著提升[14-16]。

表3 析因設計結果分析表Table 3 Analysis of factorial design experiment results

2.2 復合膜的表征

首先對最優化組成復合膜進行紅外光譜表征結構表征。殼聚糖、明膠及復合膜的紅外光譜圖見圖2。

殼聚糖的吸收峰中，3 439.8 cm-1為N-H 和O-H的伸縮振動產生，2 925.0 cm-1為C-H 伸縮振動，1 631.0 cm-1為 C＝O 的伸縮振動，即酰胺 I 帶[17]。明膠的吸收峰中，3 441.1 cm-1為N-H 和O-H 的伸縮振動產生，2 925.4 cm-1為 C-H 伸縮振動，1 637.6、1459.2 cm-1及1 261.8 cm-1分別為酰胺I 帶，酰胺II 帶和酰胺III帶[18]。復合膜的吸收峰中，3 437.1 cm-1為N-H 和O-H的伸縮振動產生，2 925.8 cm-1為C-H 伸縮振動，1 635.2、1 458.2 cm-1及 1 266.8 cm-1分別為酰胺 I 帶，酰胺II 帶和酰胺III 帶。與明膠膜相比，復合膜的特征峰幾乎都向低波段偏移，但未超過殼聚糖的特征峰波數。研究表明，若兩種水性高分子相容性良好，分子間的氫鍵相互作用會加強，表現為羧基振動峰向低波數方向偏移[19]。由此可見，1.5%殼聚糖和1.25%明膠混合后制備的復合膜內部有較強的氫鍵作用，具有良好的相容性。

圖2 殼聚糖膜、明膠膜及復合膜紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectra of chitosan film，gelatin film and composite film

進一步應用X 射線衍射驗證殼聚糖與明膠之間的相互作用。圖3 為殼聚糖、明膠及復合膜的X 射線衍射圖譜。

圖3 殼聚糖膜、明膠膜及復合膜X 射線衍射圖Fig.3 XRD spectra of chitosan film，gelatin film and composite film

從圖3 中可以發現，殼聚糖膜的衍射峰主要在2θ 為8.16°、11.18°、18°和 22.9°處，強度分別為 389、728、738和612。明膠膜的衍射峰主要在2θ 為7.82°和20.54°處，強度分別為281 和464。復合膜的衍射峰主要在2θ為 8.18°、11.18°、18.06°和 22.6°，強度分別為 385、535、640 和602。與殼聚糖膜和明膠膜相比，復合膜的峰保留了殼聚糖的大部分峰，但峰的位置發生了偏移，強度有明顯變化，這可能是混入的明膠干擾了原來殼聚糖的結晶，與現有報道的膠原對殼聚糖纖維復合晶型影響類似，說明兩者之間產生了一定的相互作用[20]。

復合膜的抗拉強度、斷裂伸長率和水蒸氣透過系數是由組成膜的大分子決定的。這些大分子在成膜時是否均勻，是否完全溶解將直接影響可食膜的性質。殼聚糖/明膠膜及復合膜掃描電鏡圖見圖4。

圖4 殼聚糖/明膠膜及復合膜掃描電鏡圖Fig.4 SEM analysis of chitosan/gelatin film and composite film

從圖4 可知，殼聚糖膜表面比較平整，沒有出現明顯的氣泡；其橫斷面層次分明，較光滑。明膠膜表面相對不光滑，能看到一些白色區域，這可能是明膠沒有完全溶解或有出現顆?；内厔菰斐傻?；其橫斷面雖有分層，但是表面粗糙。復合膜的表面相對均一，很光滑，無明顯氣泡和突起物；其橫斷面比殼聚糖膜的還平整，紋理清晰。由此可見，混合后的殼聚糖和明膠形成了均一的體系，相容性好，具有較強的分子間作用力。因而復合膜緊致，機械性能良好，水蒸氣不易透過。

2.3 復合膜液的抗菌性能

作為食品包裝材料，可食復合膜具有一定的抑菌作用能有效延長食品的保質期。本研究以大腸桿菌，金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌為模型微生物，系統對照考察了最優化復合膜配方的抑菌性能。

殼聚糖/明膠膜復合膜液抑菌性能見圖5。

如圖5 所示，殼聚糖膜液和復合膜液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均有抑菌作用，而明膠膜液對測試的3 種細菌均無明顯抑菌作用（D/E/F）。

圖5 殼聚糖/明膠膜復合膜液抑菌性能Fig.5 Antimicrobial activity of chitosan/gelatin composite film solutions

殼聚糖膜液、明膠膜液和復合膜液的抑菌效率見表4。

表4 殼聚糖膜液、明膠膜液和復合膜液的抑菌效率Table 4 Bacteriostatic efficiency of chitosan，gelatin and composite film solution

由表4 可知，殼聚糖組分顯示出顯著的抑菌效應，殼聚糖膜液的抑菌圈比復合膜液的平均大約5 mm，這是因為復合膜液中1.5%殼聚糖絕對加入量低于參照組殼聚糖膜液中的加入量，使復合膜液抑菌試驗組（G/H/I）培養基內部平均殼聚糖濃度低于殼聚糖膜液對照組（A/B/C），抑菌效應與殼聚糖濃度呈正相關關系，與現有報道完全一致[4，14]。

3 結論

當殼聚糖濃度為1.5%、明膠濃度為1.25%時，制備出來的復合膜機械性能良好，水蒸氣透過系數較低，符合可食膜作為食品包裝材料的要求。通過紅外光譜、X 射線衍射、掃描電鏡等手段對復合膜進行進一步表征，結果表明與殼聚糖膜和明膠膜相比，復合膜的內部分子之間有較強的氫鍵和分子間作用力，膜內部致密，水蒸氣不容易通過。抗菌試驗表明，復合膜液對于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌具有顯著的抑制作用。因此，該復合膜在食品包裝上具有較好的應用價值。