頭孢拉定對尾草履蟲形態和種群數量的影響研究

劉曉航，李璟，謝明松，黃宇飛

（成都理工大學生態環境學院，四川 成都 610059）

水環境中藥物的殘留問題對當前水體安全而言是一個新的挑戰[1]。現有污水處理工藝主要是消除常規化學污染物如COD、BOD等[2-5]，并沒有明確針對抗生素類藥物（如頭孢類、磺胺類等）的處理方法。這類藥物在城市生活污水、動物養殖場污水、醫院污水、地表水、地下水、飲用水、海水等水體中均有檢出[6-8]。據報道，水環境抗生素污染不僅可能誘導耐藥性致病菌的產生，毒害水生生物，而且可通過污染飲用水、土壤和食物等對人體健康產生潛在危害[1，7]。

頭孢類抗生素是當今世界上研發最活躍、應用最廣泛的抗生素類藥物，關于其在水環境中行為規律的研究報道較少，僅有對水環境細菌、大型生物影響的報道[8]。頭孢類抗生素對水生生物的生態毒性研究多以魚類和藻類等多細胞動物或植物為對象，對原生動物的影響研究鮮有報道。原生動物以藻類、細菌及有機物碎屑為食，處于食物鏈底部，在水生生態系統的物質循環和能量流動中具有重要作用；同時原生動物對環境因子敏感，可將毒性效應沿食物鏈傳遞[9]。尾草履蟲是原生動物中較早用于毒理學研究的模式生物，具有體積小、生命力強、易于培養等特點。本研究以尾草履蟲（Paramecium caudatum）為研究對象，探索其在頭孢拉定水環境中的響應，以期對環境污染防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑和受試生物 頭孢拉定（RAD），純度97%，購自齊魯制藥有限公司。

尾草履蟲，購自山東某公司。草履蟲母液為預先用稻草培養基培養5 d的草履蟲。

1.2 主要儀器 恒溫恒濕培養箱、微量移液器、高壓滅菌鍋、抽濾漏斗等。

1.3 抗生素的配制 先取頭孢拉定以蒸餾水為溶劑配制成10 g/L原液，頭孢拉定對尾草履蟲 的作用濃度梯度設置為0、10、30、50、100、300 μg/mL。

1.4 培養基的配制 稻草浸出液培養基制作方法：干稻草10 g加入蒸餾水中煮沸5 min，定容至1 000mL。

1.5 毒性效應試驗方法

1.5.1 頭孢拉定對尾草履蟲形態的影響 向配制好的10 g/L稻草培養基中加入不同濃度的頭孢拉定抗生素，使其終濃度分別為0、10、30、50、100、300 μg/mL，然后分別向其中加入0.1 mL草履蟲母液，置于20 ℃恒溫恒濕培養箱中，培養5 d。第5 d時每個培養基各取5 mL，經飽和升汞溶液固定后，于3 000 r/min離心5 min，收集沉淀斑在光學顯微鏡下觀察。每組隨機選10個草履蟲，在顯微鏡下測量細胞大小，統計并進行方差分析。

1.5.2 頭孢拉定對尾草履蟲種群數量的影響 向配制好的10g/L稻草培養基中加入不同濃度的頭孢拉定抗生素，使其終濃度分別為0、10、30、50、100、300 μg/mL，然后分別向其中加入0.1 mL草履蟲母液，置于20 ℃恒溫恒濕培養箱中，每24 h在光學顯微鏡下觀察并記錄尾草履蟲的活體數量，持續記錄7 d，每個頭孢拉定濃度組做5個平行試驗。

1.6 數據分析 使用Origin 2018軟件統計試驗數據，并進行方差分析檢驗差異顯著性和誤差分析。使用ImageJ圖像處理軟件對草履蟲個體形態進行測量。

2 結果與討論

2.1 頭孢拉定對尾草履蟲個體形態的影響 頭孢拉定對尾草履蟲個體形態的影響結果如表1所示。在本試驗頭孢濃度范圍內，尾草履蟲個體的體長隨著頭孢拉定濃度的增加而減小，而體寬變化不明顯。在高效氯氰菊酯對草履蟲的個體生長以及2，4-D丁酯對草履蟲的影響研究[10]中也發現了類似結果。

表1 頭孢拉定對尾草履蟲個體形態的影響 μm

圖1 各濃度頭孢拉定條件下尾草履蟲種群數量的變化

2.2 頭孢拉定對尾草履蟲種群數量的影響 各濃度頭孢拉定對尾草履蟲種群數量的影響結果如圖1所示。整體而言，隨著頭孢拉定濃度的增加，尾草履蟲的種群數量遞減。在頭孢拉定濃度為0、10、30 μg/mL時，尾草履蟲種群數量的峰值出現在第5 d；在頭孢拉定濃度為50 μg/mL時，尾草履蟲種群數量的峰值出現在第4 d；當頭孢拉定濃度為300 μg/mL時，該組已觀察不到尾草履蟲。可見隨頭孢拉定濃度的增加，尾草履蟲的種群數量遞減，且響應時間縮短。

經統計分析，10 μg/mL頭孢拉定組的尾草履蟲數量與對照組（0 μg/mL頭孢拉定）相比差異不顯著（P＝0.066 5）；30、50、100 μg/mL頭孢拉定組與對照組相比差異顯著（P值分別為0.010 8、0.002和0.000 4，均小于0.05）。隨著頭孢拉定濃度的增加，與對照組的差異越明顯，說明頭孢拉定對尾草履蟲有明顯的抑制作用。

頭孢拉定為廣譜抗生素，作用機制與其他頭孢菌素相似，主要抑制細菌細胞壁的合成，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有殺滅作用[11]。尾草履蟲作為原生動物沒有細胞壁，而本試驗發現頭孢拉定對尾草履蟲有明顯的抑制作用，因此頭孢拉定可能存在某種能夠抑制尾草履蟲生長的作用機制。在四環素及鹽酸四環素對尾草履蟲的毒性效應研究[12]，幾種新生污染物對嗜熱四膜蟲的分子生態毒性研究以及四環素類抗生素對纖毛蟲的毒性效應研究中，同樣發現了原生動物在受抗生素脅迫時生長發育均受到抑制。說明抗生素的使用對原生動物的生存環境以及整個生態環境存在影響。

3 結論

原生動物尾草履蟲具有明顯的死亡特征，易于養殖，容易鑒定和觀察。本研究發現頭孢拉定對原生動物尾草履蟲具有毒性效應，可以改變尾草履蟲的數量和形態。以頭孢拉定為代表的頭孢類抗生素的濫用，可能對生物鏈具有潛在影響，因此必須重視對抗生素生物學和環境毒性的監測和評價。