醋酸艾司利卡西平有關物質HPLC分析方法研究

溫秀紅，吳小翠，郭 芳,肖 引

(1.西安新通藥物研究有限公司，陜西 西安 710077；2.武警陜西省總隊醫院，陜西 西安 710054)

1 引言

醋酸艾司利卡西平是 Sunovion Pharma 開發的 S-利卡西平醋酸酯前藥，是一種新型抗癲癇藥物，S-利卡西平是奧卡西平的主要活性代謝產物，通過阻止電壓門控鈉通道來產生抗驚厥作用[1]。醋酸艾司利卡西平口服吸收快、半衰期長、藥物動力學呈線性，無明顯的藥物相互關系。與卡馬西平、奧卡西平相比較，醋酸艾司利卡西平治療效果更加顯著[2]。醋酸艾司利卡西平于2009年在歐洲上市，商品名為Zebinix，2013年被 FDA 批準用于成人癲癇部分性發作，目前國內還未上市[3-4]。目前，2015版《中國藥典》、《美國藥典》、《英國藥典》和《歐洲藥典》均未收載本品質量標準，因此，本文對自主研發合成工藝路線下可能產生的雜質進行分析，對醋酸艾司利卡西平有關物質開發了相應的分析方法，并對其進行方法學研究。

2 儀器與試藥

島津LC-2010AHT 高效液相色譜儀；梅特勒GB204電子天平；醋酸艾司利卡西平對照品(批號：D140302，來源：西安新通藥物研究有限公司)；起始物料(批號：BH-AB03081-140316，來源：上海瀚鴻化工科技有限公司)；中間體I(批號：ESL-1-140402，來源：西安新通藥物研究有限公司)；中間體II(批號：ESL-2-140402，來源：西安新通藥物研究有限公司)；雜質A(批號：A140301，來源：西安新通藥物研究有限公司)；奧卡西平(批號：100657-201102，來源：中國藥品生物制品檢定所)；環氧化物(批號：14-AZC-52-1，來源：加拿大TRC公司)；磷酸氫二鉀(分析純)，甲醇(色譜純)，乙腈(色譜純)，水為純化水。

3 雜質分析

根據我們自主研發的合成工藝，本品可能引入的雜質情況如下：(1)從合成工藝路線分析，以10-甲氧基亞氨基芪為起始物料，反應生成中間體I，中間體I經過不對稱還原反應后生成中間體II和中間體II對映體，再經過乙?；磻?，與氯磺酰異氰酸酯發生取代反應得到醋酸艾司利卡西平。(2)本品為乙酸酯類，不穩定，容易在堿性中水解，生成雜質A。(3)本品結構中的手性來源于不對稱還原反應過程，故成品中可能還會存在對映異構體。(4)本品體內代謝產物可能產生奧卡西平及卡馬西平環氧化物。綜合上述分析結果，本品中主要雜質：各反應中間體、水解雜質A、奧卡西平及卡馬西平環氧化物以及對映異構體。

4 方法與結果

4.1 色譜條件[5]

色譜柱：sepax C-18(150 mm×4.6 mm,5 μm填料)；流動相A為0.01 mol/L磷酸氫二鉀-甲醇(80∶20)，流動相B為乙腈-甲醇-水(75∶5∶20)，梯度洗脫程序見表1；檢測波長：210 nm；柱溫：25 ℃；流速：1 mL/min；進樣量：10 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution procedure

4.2 專屬性

4.2.1 樣品配制

空白溶劑：甲醇。

系統混合溶液：稱取起始原料、中間體Ⅰ、中間體Ⅱ、雜質A、奧卡西平和環氧化物約10mg，分別置25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為雜質儲備液，分別取奧卡西平和環氧化物雜質儲備液50μL，取起始原料、中間體Ⅰ、中間體Ⅱ、雜質A儲備液250μL，置含有醋酸艾司利卡西平約10mg 的25mL量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為混合溶液。

表2 強制降解樣品制備Tab.2 Preparation of forced degradation sample

4.2.2 測定方法

分別取上述溶液個10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖1～圖4。

4.2.3 結果

圖1 有關物質混合溶液色譜圖Fig.1 chromatogram of related compound for Mix solution

圖2 強制降解重疊圖(1)Fig.2 overlap chromatogram of forced degradation(1)

圖3 強制降解重疊圖(2)Fig.3 overlap chromatogram of forced degradation(2)

4.2.4 峰純度試驗

選用強制降解樣品溶液，在帶光二極管陣列檢測器的液相色譜儀中進樣，檢測峰純度。結果顯示強制降解溶液和未降解溶液的主峰峰純度大于其單點純度閾值，可表明在此實驗條件下，主峰中未包裹其他雜質，表明本系統適用性良好。

4.2.5 結論

從上述系統溶液看出，各雜質的分離度均符合要求。從上述強制降解試驗數據可以看出，雜質A主要在酸堿破壞條件下產生，且均為主要降解雜質，是由本品結構中七元環上的酯鍵斷裂形成。其他條件下，幾乎沒有雜質降解產生。在各降解條件下，主峰純度良好，未包裹其他雜質，雜質之間以及雜質與主峰之間的分離度良好，色譜條件良好。

4.3 線性關系考察

取醋酸艾司利卡西平對照品約25 mg ，置25 mL量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL 置100 mL量瓶中，再精密量入濃度為0.04 mg/mL的各雜質儲備液各1 mL，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為測定溶液。精密吸取測定溶液5,8,10,12和15 μL，按"4.1"項下色譜條件進樣分析，以濃度(X,ng)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，進行線性回歸，結果顯示，各雜質在約相當于供試品進樣量的0.05%～0.15%范圍之間，線性關系良好，見表3。

圖4 強制降解重疊圖(3)Fig.4 overlap chromatogram of forced degradation(3)

表3 線性關系Tab.3 linear relation

4.4 重復性試驗

取本品約10 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液，分別配制6份，精密吸取10 μL進樣，記錄色譜圖。結果顯示，6份供試品溶液雜質量均無明顯差異，均只檢出一個未知雜質，未知雜質含量均為0.06%，表明重復性良好。

4.5 回收率試驗

取本品約10 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為本底溶液，精密量取本底溶液1 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液；再精密量取含起始原料，中間體I，中間體II，雜質A，奧卡西平和環氧化物約 0.004 mg/mL的各雜質溶液125,250和375 μL，分別置于已加入本品約10 mg的25 mL量瓶中，加甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，分別作為限度濃度50%、100%和150%的溶液，平行配置三份。分別精密量取上述溶液10 μL，記錄色譜圖，各雜質按照加校正因子的自身對照法計算測得量，將測得量減去本底含量，除以加入量計算回收率。結果起始物料、中間體I、中間體II、雜質A、奧卡西平、環氧化物回收率分別為91.8%,90.8%,86.9%,99.9%,87.2%和87.9%，RSD分別為6.6%,5.9%,4.3%,5.4%,4.4%和4.7%。

4.6 檢測限與定量限試驗

取醋酸艾司利卡西平適量，加甲醇配制成一定濃度的溶液，按信噪比S/N應不小于3和信噪比S/N應不小于10分別確立檢測限和定量限。同時計算檢測限和定量限時進樣濃度。結果表明，當樣品濃度為0.4 mg/mL時，定量限符合檢測靈敏度要求，能被有效檢出。

4.7 穩定性試驗

取本品約10 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，做為供試品溶液，放置于室溫條件下，分別在0,2,4,6和8 h進樣，記錄色譜圖。圖譜顯示，供試品溶液隨著放置時間的延長，雜質A降解產生，在8 h內由未檢出增長到0.07%，表明供試品溶液不穩定，因此需臨用新制。

4.8 耐用性試驗

稱取起始原料、中間體Ⅰ、中間體Ⅱ、雜質A、奧卡西平和環氧化物約10 mg，分別置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為雜質儲備液，分別取奧卡西平和環氧化物雜質儲備液50 μL，取起始原料、中間體Ⅰ、中間體Ⅱ、雜質A儲備液250 μL，置含有醋酸艾司利卡西平約10 mg 的25 mL量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為混合溶液。分別選用色譜柱sepax C-18柱(4.6×150 mm，5 μm)、DIKMA C-18柱(4.6×150 mm，5 μm)、IntertSustain C-18(4.6×150 mm，5 μm)和Xtimate C-18柱(4.6×150 mm，5 μm)及島津LC-2010AHT高效液相色譜儀和waters alliance 2486高效液相色譜儀進行測定。結果表明，當更換不同色譜柱，更換不同型號和品牌色譜儀器時，雖然雜質和主峰保留時間有所差異，主峰的保留時間在10～17 min之間變化，但均能實現各已知雜質與主峰的分離和檢測，方法耐用性良好。

5 討論

本文建立的HPLC分析方法能實現醋酸艾司利卡西平與雜質，雜質與雜質的有效分離，其中溫度對于醋酸艾司利卡西平及其有關物質的保留時間有影響，但對分離度沒有顯著影響，在最終建立的梯度色譜條件下，各成分間達到比較理想的分離。

通過對樣品的強酸、強堿、氧化、水浴、光照、高溫破壞試驗，結果顯示主峰及已知雜質分離度良好，該檢測方法能有效檢測本品有關物質。通過溶液穩定性考察，本品供試品溶液隨著放置時間的延長，雜質A降解產生，在8 h內由未檢出增長到0.07%，表明供試品溶液不穩定，因此在樣品檢測過程中，溶液應臨用現配。

本文開發的醋酸艾司利卡西平有關物質的檢查方法，用來檢測除對映異構體以外的有關物質。方法學考察表明該色譜方法靈敏度高，可以有效檢出降解雜質，二極管陣列檢測器檢測峰純度符合要求，證明本方法具有專屬性，能夠滿足雜質檢測的需要。