HPLC-MS/MS法檢測花生中咯菌腈的殘留量

馬新剛，張愛娟，梁 林，左伯軍

(山東省農藥科學研究院 山東省化學農藥重點實驗室，山東 濟南 250033)

花生是我國重要的經濟和油料作物。根腐病是影響花生產量和品質的主要病害之一,各生育期均可發病。近年來國內市場花生需求增多,花生種植面積不斷增大,花生重茬面積也隨之擴大,根腐病的發生有加重趨勢,導致花生缺苗斷壟、爛根死苗,嚴重時可導致花生成片死亡，造成重大生產經濟損失[1]。目前，對咯菌腈的殘留報道較少[2]，涉及的作物主要有棉花、人參、水果和蔬菜等，檢測方法主要為液相色譜法和液相色譜串聯質譜法[3-8]，但未見咯菌腈在花生中殘留分析方法的研究。

本文參考QuEChERS方法結合高效液相色譜串聯質譜儀，建立了花生仁和秸稈中咯菌腈殘留量的分析檢測方法，該方法試驗樣品前處理簡單快速、咯菌腈的定性定量準確、檢測結果重現性好。

1 材料與方法

1.1 儀器與藥劑

高效液相色譜-質譜聯用儀(LCMS-8030)，SHIMADZU公司；多管渦旋混合儀(MTV-100)，杭州奧盛儀器有限公司渦旋儀；精密電子天平(AL204)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；離心機(TDL-5-A)，上海安亭科學儀器廠。

氯化鈉(分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司)；乙腈(色譜純，瑞典歐森巴克環境化學公司；分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司)；乙酸銨(色譜純，Fisher Chemical)；十八烷基硅烷(C18)吸附劑(安捷倫科技有限公司)；咯菌腈標準品(純度為99.0%，購自德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司)。

溶液配制：準確稱取0.0270 g咯菌腈標準品，將準確稱重的標準品轉移至50 mL容量瓶中，用乙腈溶解，待標準品完全溶解，定容得535 mg/L咯菌腈標準溶液，置于4℃冰箱中保存，使用時用乙腈稀釋成100mg/L的咯菌腈標準溶液。

1.2 前處理方法

將花生仁(秸稈)用食品調理儀粉碎，準確稱取混勻的樣品10.0 g(秸稈5.0g)于50 mL具塞式塑料離心管中，加入10 mL乙腈和10 mL超純水，用渦旋儀高速渦旋4 min，加入5g氯化鈉，劇烈振蕩30s，5000r/min離心4 min至液面分層，取上清液1 mL至裝有50mg C18的2mL離心管中，高速渦旋1min，靜置1min，上清液過0.22 μm微孔濾膜，待測。

1.3 色譜及質譜檢測條件

色譜條件：Shim-pack XR-ODSⅡ色譜柱(75 mm×2.0 mm，2.2 μm)；柱溫為室溫；流動相： 5mmol乙酸銨水溶液+乙腈體積比20：80；進樣體積：2 μL；流速：0.4 mL/min。

質譜：電噴霧離子源ESI(-)；毛細管電壓：3.5 kV；加熱塊溫度：400 ℃；干燥氣溫度：250 ℃；干燥氣流量：15 L/min；霧化氣流量：3 L/min；反應氣(Ar)壓力：230kpa。定量分析結果(見表1)。

表1 咯菌腈的質譜檢測條件

2 結果與分析

2.1 儀器條件的確定

選用1 mg/L的咯菌腈標準溶液，在電噴霧離子源正/負方式下進行全掃描(m/z 50～300)，根據掃描結果，選擇合適的電離方式和分子離子峰。通過比較儀器響應值，發現在ESI(-)下咯菌腈[M-1]峰(m/z 247)為最強峰。選擇[M-1]峰(m/z 247)做母離子，進行子離子掃描，優化碰撞池電壓，分別獲得定量離子對m/z 247>247和定性離子對m/z 247>126，相應的碰撞能量分別為25V和35V。質譜圖(見圖1)。

a.全掃描質譜圖;b.二級質譜圖圖1 咯菌腈的全掃描質譜圖和二級質譜圖

色譜條件的選擇，通過試驗表明5mmol乙酸銨水溶液+乙腈體積比為20∶80，流速為0.4mL/min時，咯菌腈與其余雜質分離效果好且基線平穩、峰型對稱。溶劑標樣色譜圖(見圖2)。

圖2 咯菌腈溶劑標樣(0.1 mg/L)

2.2 咯菌腈線性關系

將咯菌腈(10mg/L)的標準溶液用乙腈、花生仁空白基質溶液、秸稈空白基質溶液配制成0.01、0.05、0.1、0.5、1mg/L系列標準溶液。按1.3節條件測定，每個質量濃度重復3次，以標準溶液濃度為橫坐標，定量離子對峰面積為縱坐標，繪制工作曲線。在 0.01～1 mg/L 范圍內，咯菌腈在乙腈、花生仁空白基質溶液、秸稈空白基質溶液中均呈良好的線性關系 (見表2)。目前常用的基質效應的評價方法是采用基質標準曲線擬合的線性方程斜率與溶劑標準曲線線性方程斜率比 ( Slope ratio，SR)，可以采用 SR 比值或其百分數表示。若 SR =100% (或 1)，說明無基質效應; 若SR < 100%，呈基質抑制效應; 若 SR > 100%，呈基質增強效應[9]。本研究中，咯菌腈在兩種基質中均呈現基質增強效應。為校正和消除基質效應影響，本研究均采用基質匹配標準溶液。

表2 咯菌腈的線性方程、相關系數、斜率比

2.3 咯菌腈的添加回收率和精密度

在空白花生仁基質中按照0.01～1mg/kg 3個添加水平，在空白秸稈基質中按照0.05～2mg/kg 3個添加水平分別添加咯菌腈標準溶液，結果表明(見表3)：咯菌腈在花生仁中添加回收率為86%～114%，相對標準偏差為7%～8%；咯菌腈在花生秸稈中添加回收率為79%～107%，相對標準偏差為5%～8%，符合農藥殘留分析要求。目標峰峰型較好且無雜質干擾(圖3和圖4)。

表3 咯菌腈在花生仁和秸稈中的添加回收率及相對標準偏差

圖3 花生仁中添加色譜圖(添加0.1 mg/kg)

2.4 方法定量限

以最低添加水平作為方法的定量限(LOQ)，咯菌腈在花生仁的定量限為0.01 mg/kg，秸稈中的定量限為0.05mg/kg。

3 結論

本文參照QuEChERS方法，建立了咯菌腈在花生仁及秸稈中的殘留分析方法，樣品經乙腈和水提取，C18凈化，高效液相色譜串聯質譜儀檢測。咯菌腈在花生仁中的定量限為0.01mg/kg，在秸稈中的定量限為0.05mg/kg，平均回收率在92%～105%之間。該方法準確可靠、簡單快速、重現性良好，滿足農藥殘留分析要求，為咯菌腈及其制劑在其他農產品中殘留檢測提供了參考依據。

圖4 花生秸稈中添加色譜圖(添加0.5 mg/kg)