基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的防己黃芪湯防治2型糖尿病的潛在作用機(jī)制研究

陳璟 徐貝貝 徐墜成 單鑫 王威 許惠琴 呂志陽(yáng)

摘 ? 要：為了基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究防己黃芪湯防治2型糖尿病的潛在作用機(jī)制，采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)及技術(shù)平臺(tái)（TCMSP），按照口服生物利用度OB≥30%和類藥性DL≥0.18篩選處方中的活性成分及其相關(guān)靶點(diǎn)，通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)找出對(duì)應(yīng)官方基因名稱。利用疾病靶點(diǎn)相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索與2型糖尿病相關(guān)的靶點(diǎn)基因。將活性成分所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)基因和2型糖尿病相關(guān)的靶點(diǎn)基因進(jìn)行交集獲得兩者的共同基因即為防己黃芪湯治療2型糖尿病的關(guān)鍵靶點(diǎn)。使用Cytoscape軟件構(gòu)建中藥-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)度值進(jìn)行篩選，尋找該方劑防治2型糖尿病的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)及ClueGo插件對(duì)關(guān)鍵作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO注釋分析和KEGG通路分析，從而探究防己黃芪湯干預(yù)2型糖尿病的生物過(guò)程及作用通路。結(jié)果顯示，篩選得到防己黃芪湯122個(gè)活性成分及242個(gè)潛在作用靶點(diǎn)，其中，與2型糖尿病重復(fù)的83個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)中STAT3，AKT1，TNF，JUN，TP53，MAPK14，MAPK1，MAPK8可能通過(guò)調(diào)控AGE-RAGE信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路、FoXO信號(hào)通路發(fā)揮治療作用。由此得出結(jié)論：通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)防己黃芪湯防治2型糖尿病的關(guān)鍵靶點(diǎn)及其相關(guān)信號(hào)通路，推測(cè)該方劑對(duì)2型糖尿病的潛在作用機(jī)制，大都和脂代謝的過(guò)程、氧化應(yīng)激過(guò)程相關(guān)，為進(jìn)一步闡明防己黃芪湯對(duì)2型糖尿病的作用機(jī)制提供了科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：防己黃芪湯;2型糖尿病;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);潛在靶點(diǎn)

糖尿?。―iabetes Mellitus，DM）為臨床上常見(jiàn)的一種代謝紊亂性疾病，在全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類身體健康[1]，其患者以長(zhǎng)期高血糖為主要特征，嚴(yán)重時(shí)通常伴有如心血管疾病、腎病、眼底病變等多種并發(fā)癥。其中，2型糖尿?。═ype 2 Diabetes Mellitus，T2DM ）占糖尿病患者90%以上[2]，陳思蘭等發(fā)現(xiàn)其發(fā)病與胰島素抵抗（Insulin-Resistance，IR）密不可分，因胰島素抵抗導(dǎo)致患者胰島素分泌相對(duì)不足。西醫(yī)治療多通過(guò)控制患者飲食或使用降糖藥物來(lái)保證治療效果[3]，然而長(zhǎng)期服用容易產(chǎn)生許多副作用，降低療效。為了尋找能夠防治2型糖尿病的有效藥物，本研究將目光放到傳統(tǒng)的中醫(yī)藥上。中醫(yī)藥在防治DM方面歷史悠久，積累了大量的寶貴臨床經(jīng)驗(yàn)，近年來(lái)文獻(xiàn)報(bào)道屢見(jiàn)不鮮。

DM屬中醫(yī)消渴病范疇，中醫(yī)認(rèn)為IR的發(fā)生為脾失健運(yùn)、肝失疏泄、腎陽(yáng)不化等臟腑功能失調(diào)所致[4]。張景岳在《景岳全書·痰飲》中說(shuō)：“五臟之病，雖皆能生痰，然無(wú)不由于脾腎?！逼⒛I虛損導(dǎo)致機(jī)體津液代謝異常，痰濕困脾，阻滯機(jī)體組織間物質(zhì)交換，影響胰島素和葡萄糖、脂質(zhì)、蛋白等水谷精微代謝，表現(xiàn)為痰濁、血瘀，二者互相影響，共同加重IR程度。由此可見(jiàn)，可以通過(guò)改善IR來(lái)治療T2DM，從中醫(yī)辯證角度出發(fā)，采用一些活血化瘀、理氣化痰、滋陰補(bǔ)腎的中藥復(fù)方，將會(huì)在治療T2DM上大有成效。據(jù)《金匱要略》記載，防己黃芪湯（FJHQT）具有補(bǔ)氣健脾、祛風(fēng)除濕、利水消腫之功效。防己黃芪二者配伍，祛風(fēng)利濕不傷表，固表止汗不留邪，白術(shù)作為臣藥健脾利濕，甘草又調(diào)和諸藥，使其相得益彰[5]。研究表明[6-9]，F(xiàn)JHQT確有調(diào)血脂、降血糖、減肥的功效。賈真等[10]通過(guò)大鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)防己黃芪湯可以提高高脂飼養(yǎng)大鼠的胰島素敏感性，改善脂質(zhì)代謝紊亂。目前，F(xiàn)JHQT中各單味藥的化學(xué)成分雖有報(bào)道，但鑒于中藥成分復(fù)雜而DM又是多基因、多靶點(diǎn)作用的疾病，對(duì)該方劑防治T2DM仍缺乏系統(tǒng)的研究。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過(guò)不同層次的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建系統(tǒng)地揭示藥物作用靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)之間的關(guān)系，從微觀層面觀察復(fù)雜藥物對(duì)多靶點(diǎn)疾病的干預(yù)和影響。本研究擬通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法篩選FJHQT中各單味藥的活性成分及作用靶點(diǎn)，檢索已知的T2DM的相關(guān)靶點(diǎn)，利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)及ClueGo分析探究防己黃芪湯干預(yù)2型糖尿病的潛在作用通路，為臨床治療T2DM提供新思路。

1 ? ?材料與方法

1.1 ?FJHQT處方中各單味藥活性成分的篩選

通過(guò)查詢《中國(guó)藥典2015版》所得防己黃芪湯處方中4味藥分別是：防己、黃芪、白術(shù)、甘草。采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)及技術(shù)平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）篩選防己、黃芪、白術(shù)、甘草4味藥中的活性成分。TCMSP包括：《中國(guó)藥典2015版》含有的400多種中藥材，800多個(gè)相關(guān)疾病的基因，3 000多個(gè)靶點(diǎn)基因和20 000多種活性成分，TCMSP作為可靠的中草藥信息數(shù)據(jù)平臺(tái)，為廣大學(xué)者搜集中藥復(fù)方所含成分及其相關(guān)作用靶點(diǎn)等相關(guān)化學(xué)信息提供了便利。研究人員可通過(guò)設(shè)置口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）、類藥性（Drug Likeness，DL）等ADME參數(shù)獲取自己想要的有效信息。FJHQT作為湯劑，臨床上通常以口服方式給藥，故按照口服生物利用度≥30%和類藥性≥0.18進(jìn)行篩選得到FJHQT中的活性成分，記錄其相關(guān)靶點(diǎn)蛋白名和在其他文獻(xiàn)中收集到的關(guān)于FJHQT的重要成分及其相關(guān)靶點(diǎn)蛋白名于Excel表格中。

1.2 ?處方中潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及構(gòu)建“藥物活性成分-潛在作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

Uniprot，全稱Universal Protein，是目前信息最豐富、資源最廣的免費(fèi)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，使用者可通過(guò)其中的關(guān)鍵詞搜索到感興趣的蛋白名稱。由上述TCMSP搜索得到活性成分及其相關(guān)靶點(diǎn)蛋白名，將藥物相關(guān)靶點(diǎn)蛋白名通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)中的Uniprot KB搜索區(qū)找出對(duì)應(yīng)的官方基因名（Gene Symbol），篩選物種為人類的靶點(diǎn)基因名稱。將4味藥的基因名導(dǎo)入到Excel表格，刪除重復(fù)項(xiàng)得到全方的潛在作用靶點(diǎn)。用Cytoscape3.7.0軟件構(gòu)建“藥物活性成分-潛在作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，其中節(jié)點(diǎn)代表藥物化學(xué)成分和相應(yīng)的作用靶點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)的度值（Degree）表示藥物活性成分與作用靶點(diǎn)連線的條數(shù)，通過(guò)度值篩選可以得到與藥物活性成分高度連接的蛋白，這些蛋白在網(wǎng)絡(luò)中的作用不可忽視。

1.3 ?T2DM靶點(diǎn)的收集

檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.genecards.org/）和人類在線孟德?tīng)栠z傳平臺(tái)（http：//www.omim.org/）等與疾病靶點(diǎn)相關(guān)的數(shù)據(jù)庫(kù)，以“Type 2 diabetes Mellitus”為關(guān)鍵詞搜索與2型糖尿病相關(guān)的已知靶點(diǎn)并刪除重復(fù)項(xiàng)進(jìn)行整合。

1.4 ?關(guān)鍵作用靶點(diǎn)的獲取

將藥物潛在作用靶點(diǎn)與疾病相關(guān)靶點(diǎn)通過(guò)omicshare平臺(tái)（https：//www.omicshare.com/）繪制維恩圖，從而得到防己黃芪湯治療T2DM的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)，為后續(xù)構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖提供依據(jù)。

1.5 ?關(guān)鍵作用靶點(diǎn)的GO注釋及KEGG通路富集

利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)關(guān)鍵作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO注釋分析，將篩選條件設(shè)置為細(xì)胞的組成（cellular component），分子的功能（molecular function）和生物的過(guò)程（biological process）3個(gè)篩選條件，最后再點(diǎn)擊Functional Annotation Table，得到GO注釋結(jié)果。利用Cytoscape3.7.0軟件中的ClueGo插件對(duì)關(guān)鍵作用靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路分析，將關(guān)鍵作用靶點(diǎn)輸入到GENES一欄，選擇物種為人類，再設(shè)定P<0.05，選擇KEGG通路，最后點(diǎn)擊start開(kāi)始分析，得到防己黃芪湯干預(yù)2型糖尿病的潛在作用通路。

2 ? ?實(shí)驗(yàn)過(guò)程分析

2.1 ?FJHQT活性成分及相關(guān)靶點(diǎn)信息

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)查詢到防己的化學(xué)成分50個(gè)，黃芪的化學(xué)成分87個(gè)，白術(shù)的化學(xué)成分55個(gè)，甘草的化學(xué)成分280個(gè)，共計(jì)472個(gè)化學(xué)成分。經(jīng)OB、DL等藥代動(dòng)力學(xué)（ADME）參數(shù)篩選得到防己的活性成分3個(gè)，黃芪的活性成分20個(gè)，白術(shù)的活性成分7個(gè)，甘草的活性成分92個(gè)，共計(jì)122個(gè)活性成分，將其相關(guān)靶點(diǎn)蛋白名記錄于Excel表格中。

2.2 ?FJHQT潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果及“活性成分-潛在作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)分析

對(duì)上述122個(gè)活性成分進(jìn)行潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)并進(jìn)行靶點(diǎn)基因名稱的修正，通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)收集122個(gè)活性成分的潛在作用靶點(diǎn)，打開(kāi)Uniprot（http：//www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇Uniprot KB搜索區(qū)，將潛在作用靶點(diǎn)的蛋白名鍵入得到對(duì)應(yīng)的官方基因名，剔除非人源靶點(diǎn)。將活性成分、相關(guān)靶點(diǎn)蛋白名、官方基因名3列數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)于Excel表格中，刪除重復(fù)項(xiàng)得到1 994條對(duì)應(yīng)關(guān)系。將官方基因名單獨(dú)列出去后得到FJHQT的潛在作用靶點(diǎn)242個(gè)。將122個(gè)活性成分及242個(gè)潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.7.0 軟件進(jìn)行可視化構(gòu)建“活性成分-潛在作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，揭示藥物成分與靶點(diǎn)之間的關(guān)系。按度值篩選排名前20的有槲皮素（Quercetin），PTGS2，ESR1，CALM1，HSP90AB1，NOS2，AR，PPARG，山奈酚（kaempferol），PAL_GLEAN10007028，PRSS1，GSK3B，CDK2，ESR2，CCNA2，F(xiàn)10，NCOA2，SCN5A，MAPK14，CHEK1。

2.3 ?T2DM相關(guān)靶點(diǎn)信息

通過(guò)人類在線孟德?tīng)栠z傳平臺(tái)OMIM檢索到T2DM相關(guān)靶點(diǎn)31個(gè)，通過(guò)Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到T2DM相關(guān)靶點(diǎn)408個(gè)，共計(jì)439個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)。

2.4 ?關(guān)鍵作用靶點(diǎn)的生物功能預(yù)測(cè)及作用通路分析

通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)上述關(guān)鍵作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO注釋分析，根據(jù)錯(cuò)誤分析率（FDR）<0.05篩選得到20條GO條目（見(jiàn)圖1），其中，大多數(shù)關(guān)于生物學(xué)的過(guò)程主要涉及：內(nèi)皮細(xì)胞凋亡過(guò)程的調(diào)控、DNA轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)、MHC Ⅱ類生物合成過(guò)程的調(diào)節(jié)、肽基絲氨酸磷酸化過(guò)程、脂多糖介導(dǎo)信號(hào)通路等。關(guān)于分子功能主要涉及細(xì)胞因子活性、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性、MAP激酶活性。此外，有的條目還顯示與炎癥反應(yīng)、血管生成有關(guān)。GO注釋分析結(jié)果如圖1所示。通過(guò)Cytoscape3.7.0 軟件中的ClueGo插件對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，其中P<0.05的通路有11條被顯著富集（見(jiàn)圖2），分別是：AGE-RAGE信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、T細(xì)胞受體通路、松弛素信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、ErbB信號(hào)通路、胰島素信號(hào)通路、鞘脂信號(hào)通路、FoXO信號(hào)通路，表示FJHQT可能通過(guò)這些通路起到防治T2DM的作用，應(yīng)予以重點(diǎn)關(guān)注。

3 ? ?實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

現(xiàn)階段，我國(guó)糖尿病患者已經(jīng)有9 000多萬(wàn)人，而其中2型糖尿病居多，2型糖尿病是一種慢性代謝功能障礙，其特征在于進(jìn)行性胰島素抵抗和高血糖癥。現(xiàn)代分子學(xué)研究表明，不同信號(hào)通路及其相關(guān)蛋白、基因參與調(diào)控該疾病的發(fā)生與發(fā)展，相互作用機(jī)制復(fù)雜，單純通過(guò)使用降血糖、降血壓、改善微循環(huán)等“點(diǎn)對(duì)點(diǎn)”的藥物干預(yù)方式，很難推動(dòng)糖尿病治療進(jìn)展，臨床效果較差。中藥復(fù)方成分復(fù)雜，其多靶點(diǎn)的協(xié)同作用值得引起注意，防己黃芪湯在臨床治療消渴癥包括一些糖尿病并發(fā)癥方面的療效確切，但是中藥復(fù)方治療T2DM的作用機(jī)制尚不清晰。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)突破單靶點(diǎn)的研究模式，從多靶點(diǎn)研究思路出發(fā)，為探索中藥復(fù)方的療效提供新思路。本研究采用了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究思路，初步挖掘、分析防己黃芪湯多靶點(diǎn)防治T2DM可能的作用機(jī)制。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法對(duì)防己黃芪湯進(jìn)行研究，最后得到防己黃芪湯122個(gè)入血活性成分，預(yù)測(cè)了242個(gè)潛在作用靶點(diǎn)。其中槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）等活性成分可作用于多個(gè)靶點(diǎn)。槲皮素屬于植物類黃酮并且在體外具有有效的抗氧化特性，最近的文獻(xiàn)報(bào)道槲皮素可能在體內(nèi)具有抗癌和抗炎功能，與此同時(shí)，槲皮素還可以預(yù)防糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生[10]，山奈酚可用作治療糖尿病腎病的潛在治療劑。在對(duì)靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)CALM1、PTGS2等靶點(diǎn)可作用于多個(gè)潛在活性成分，這表現(xiàn)出了中藥多個(gè)成分共同作用的特征。在GO富集分析結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)主要涉及：內(nèi)皮細(xì)胞凋亡過(guò)程的調(diào)控、DNA轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)、MHC Ⅱ類生物合成過(guò)程的調(diào)節(jié)、肽基絲氨酸磷酸化過(guò)程、脂多糖介導(dǎo)信號(hào)通路等。在KEGG通路分析結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)的關(guān)鍵靶點(diǎn)主要集中作用在AGE-RAGE信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路。這些通路主要在氧化應(yīng)激、炎癥、脂質(zhì)代謝等方面具有良好的作用，并且上述通路與目前相關(guān)研究結(jié)果具有一致性，證明本研究預(yù)測(cè)出的結(jié)果具有可靠性。

4 ? ?結(jié)語(yǔ)

通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)防己黃芪湯防治2型糖尿病的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)及其相關(guān)信號(hào)通路，推測(cè)防己黃芪湯對(duì)2型糖尿病的潛在作用機(jī)制，推測(cè)結(jié)果可能主要是：內(nèi)皮細(xì)胞凋亡過(guò)程的調(diào)控、DNA轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)等。關(guān)于分子功能主要涉及細(xì)胞因子活性等。此外，有的條目還顯示與炎癥反應(yīng)、血管生成有關(guān)，為闡明防己黃芪湯對(duì)2型糖尿病的作用機(jī)制提供了科學(xué)依據(jù)，但還存在一些缺陷，主要是未對(duì)預(yù)測(cè)獲得的活性成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)和有關(guān)通路進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。為了進(jìn)一步探討其復(fù)雜的過(guò)程和作用機(jī)制，將會(huì)結(jié)合上述結(jié)果進(jìn)行更深入的實(shí)驗(yàn)研究。

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