海洋單細胞藻類的培養與觀察方法的優化研究

張媛 余蕾 雷楠 趙馨

摘 ? 要：海水微藻常見種之一的三角褐指藻，在培養觀察過程中，針對其細胞形狀多變、特定形狀細胞的生長周期不清晰等問題，結合傳統光學顯微鏡及血球計數板法，開展了對三角褐指藻單一細胞形狀（菱形）的保種、最優接種量的確定及生長周期的觀察等的分析及優化。結果顯示，實驗中運用的單一藻細胞分離、計數、生長等方法操作簡單，可為日常生物實驗中有關單細胞藻類的培養與觀察方法的優化提供數據支撐，具有一定的實踐意義。

關鍵詞：單細胞藻類;三角褐指藻;細胞形狀;計數;生長周期

硅藻是一類具有重要生態、經濟意義的單細胞真核微藻，代表性硅藻物種—三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）作為一種模式硅藻廣泛應用于藻類生理、生態方面的研究[1]。據報道，三角褐指藻是一種優質的水產蛋白餌料，富含活性物質如二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）、巖藻黃素[2]，是生產EPA的潛在原材料[3-4];是微藻生物柴油的重要原料，具有較高的中性脂三酰基甘油（TAG）[5];對二氧化碳具有極高的耐受性，其光合固碳是生物法處理工廠廢煙氣的理想途徑[6];是應用于生物監測技術的指示生物，可直接用來評價水質的安全狀況[7]，是海洋浮游生物毒性測試中常用的實驗材料[8];生長速度快，分布較廣，僅生活于海洋環境中，在中國沿岸海域均有分布[9]，取樣分析方便，有利于收集。因此，在水產養殖、食品添加、水質安全等教學實驗工作中，對于材料獲取方便、生長周期短、活性產物豐富的單細胞藻類開展相關培養研究，具有非常重要的應用價值。

有關藻生理、生態的科研工作，常常以細胞豐度變化作為研究的關鍵指標之一，也是最為直接、簡單的監測指標，在高校日常教學實驗中廣泛應用于了解浮游植物的生長狀態、生物量測定甚至環境安全質量等，實操手段簡單、實用價值高。經典的細胞計數方法是顯微鏡計數法，雖比較耗時費力但準確度高，且其計數流程簡單。然而，開展三角褐指藻生理生態等教學實驗方面的工作，需基于簡單易操作、重復性高的室內藻類培養及觀察。三角褐指藻在形狀特征方面具有多態性，總體上有4種主要形狀類型：梭形、三出放射狀、卵形[10]和十字交叉型，且不同形狀間在不同培養條件下可相互轉化[11]。同時，三角褐指藻細胞間的黏附強度也與形狀類別密切相關[12]，對實驗工作的分析造成了較大影響，包括細胞生長、不同生長階段藻細胞的周期性觀察等。本研究以加強教學實用性為目的，以常見海洋微藻三角褐指藻為研究對象，結合傳統光學顯微鏡及常用計數觀察法（血球計數板法），開展三角褐指藻單一細胞形狀的分離、保種、初始接種量確定及生長周期觀察等的實驗方法分析，優化其實驗教學流程，獲得較為簡便、快捷、準確、可行的藻細胞培養及其生理特征觀察等實驗方法。

1 ? ?材料與方法

1.1 ?藻種及其培養條件

三角褐指藻藻種由國家海洋局第三海洋研究所藻種室提供。

三角褐指藻的培養采用f/2海水液體培養基[13]，在三角錐瓶中進行富集培養。使用的海水為0.45 μm濾膜過濾的自然海水（pH 8.0±0.4，鹽度27‰～32‰）;加入藻細胞前，量取300 mL培養基裝于500 mL三角錐形瓶，經121 ℃高壓滅菌處理。培養溫度為20 ℃，光照強度為2 000～3 000 lux，光暗周期12 h∶12 h[14]。

1.2 ?主要儀器設備

主要儀器設備包括三溫區光照培養箱KB-200L-3（匡貝）、凈化工作臺SW-CJ-2D（蘇州凈化）、光學顯微鏡 ECLIPSE E200（Nikon）、血球計數板XB-K-25（求精）、高壓蒸汽滅菌鍋MJ-54A（STIK）、電子天平EX224（OHAUS）等。

1.3 ?藻類計數方法

顯微鏡計數法：將藻液用漩渦混勻器充分混勻后，加入 0.5%的戊二醛固定，然后將藻液充分混勻。準確吸取不同質量濃度的藻液細胞0.1 mL，置于血球計數板上，于光學顯微鏡下進行細胞計數，每個樣品計數3次取其平均值[15]。

2 ? ?實驗結果與討論

2.1 ?單一細胞形狀三角褐指藻的保種

三角褐指藻具有多種細胞形狀，且不同細胞形狀間可相互轉變，如梭形可變成三出放射狀，三出放射狀可變成十字交叉型，三出放射狀也可變成梭形等[10-11]。在實驗室內開展的藻類培養中也出現了該情況，如三角褐指藻經過一定周期（2～4周以上）的培養，會在同一批液體培養基中同時出現菱形、三射型，甚至是四射型等形狀不一、比例不同的藻細胞混合液，一般為保持單一的細胞形狀，常用的做法是減少培養周期并定期移出少量原液至新鮮培養基中進行重新接種。往往工作量較大，培養基用量也較多，且混入少量其他形狀細胞的概率非常大，易重新造成藻細胞形狀不純，重復后續單一形狀藻細胞的分離、純化工作。雖然可在重新接種前進行光學顯微鏡觀察，排除可能存在的其他形狀細胞，但同時也增加了很多工作量，且成功排除率較低，效率不高。針對此，經過一定時間的觀察、分析，通過參考96孔板等多孔板進行藻細胞單一形狀純化的方式，本研究將經過2周培養的單一細胞形狀的藻細胞（菱形），分批次（20 μL體積）加入到已添加新鮮f/2培養基（80 μL體積）的96孔板中（3組平行，共計96×3=288個樣品），并將其置于培養箱中培養。經過10天的光暗周期培養，從96孔板中每個小孔板中取出50 μL藻液，置于玻璃載破片上面進行全部細胞形狀的觀察，并記錄出現除菱形外的其他細胞形狀的小孔數量。部分結果如表1所示。

從結果可看出，經過10天的培養，96孔板中僅有少數微孔出現非菱形細胞，且多數為三射型細胞;單一形狀的保種成功率為（288-14）/288≈95.14%。應用該方法后又開展了幾次類似的實驗工作，獲得的單一細胞形狀的保種成功率為93.75%～100.00%，保種成功率較高。上述實驗說明，相對傳統方法，采用96孔板進行細胞形狀多變的藻單一形狀的保種，保種成功率較高，其優點是準確率高且批次數量多、試劑耗材使用量少、易于操作等，可在今后的藻類實驗教學中推廣。

2.2 ?三角褐指藻接種量確認

藻細胞生長常有不同的生長階段（停滯期、指數期、穩定期），為達到這一目的，在藻類培養過程中，需確定最初的藻細胞接種量，過低或過高都會影響后續實驗的觀察。常用的計數方法是血球計數板法，通過已設置好的藻液體積，可在光學顯微鏡下較為準確地計算出培養基中的藻細胞濃度，應用廣泛。然而，應用血球計數板法進行細胞計數有一定的濃度限制[16]。基于這一情況，本研究設置了起始細胞濃度（大于104個/mL）分在不同的兩組（A組和B組）藻細胞樣品（每組兩個平行分別是A1和A2，B1和B2）中，并計數觀察其生長情況。具體實驗過程是，取經過一定周期培養的藻細胞原液（約6.5×106個/mL）至含有相同體積（75 mL）的新鮮培養基的A1、A2、B1和B2，其中，A1和A2初始接種量是B1和B2的100倍。通過3天的計數觀察，具體結果如表2所示。

從結果可看出，稀釋了100倍的B1和B2經過血球計數板法計數后，其結果并不能真實反映藻類實際質量濃度值，且還出現藻細胞空白個數的情況。但A1和A2中藻細胞質量濃度，經計算后為4.0×105個/mL，是原始母液的6.15%，這與母液接入量的比例（1/16）基本相同。觀察藻細胞隨時間的變化情況，可看出B1和B2的藻細胞在經過4天的光暗周期培養后，基本達到了A1和A2中最初接入的藻細胞質量濃度。這說明，在應用血球計數板法計數三角褐指藻細胞質量濃度時，較好地接入細胞質量濃度應在105個/mL以上，其獲得的質量濃度值結果較為準確、可信。

2.3 ?三角褐指藻一步生長曲線及其觀察

在藻類培養過程中，常需要對不同生長階段的細胞進行各類參數的觀察、分析，常用的做法是開展一步生長曲線的實驗觀察。通過前面藻細胞單一形狀的保種、接種量的觀察，本研究對三角褐指藻的一步生長曲線情況作了進一步的分析，具體結果如圖1所示。

可以看出，初始接種量為4.0×103個/mL的三角褐指藻，在經過14天的室內恒定環境培養其生長可分為3個階段：停滯期（第1天到第4天）、指數生長期（第5天到第12天）、穩定期（超過第12天）;其細胞密度從第一天的4.0×103個/mL，到第11天的9.8×106個/mL，增長了約2 450倍。生長曲線的制定，有助于在實驗教學過程中針對學生在開展藻細胞觀察時，為初始接種量的確定、觀察時間設置、觀察頻次設置、不同生長階段細胞大小觀察、形狀變化分析以及其他形狀如三射型、四射型細胞培養等提供數據支持。

2.4 ?實驗小結

相對傳統方法，采用96孔板進行細胞形狀多變的藻單一形狀的保種，保種成功率較高，其優點是準確率高且批次數量多、試劑耗材使用量少、易于操作等。在日常教學中，為引導學生進行準確的生長周期觀察，應用血球計數板法進行三角褐指藻細胞質量濃度計數時，較好地接入細胞質量濃度應在105個/mL以上，其獲得的質量濃度值結果較為準確、可信。

3 ? ?結語

目前，多數學校（大中專）在生物專業的教學實驗課程中，多以微生物（細菌）培養來引導學生認識個體較小、繁殖力強的生物個體及其生理特征，造成了課程體系千篇一律、學生接觸面小、興趣點不足、創新力不強等常見狀況。海洋微藻與微生物（細菌）類似，個體小、數量多、易培養、易觀察、門類多等，是濱海城市海洋水體中常見的生物種，在海洋環境中具有重要生態和經濟價值，在日常教學中有的放矢地制定相關藻類培養實驗課程，可進一步拓寬學生知識面，提高其實驗積極性，有助于實驗技術技能的增強。

海洋微藻作為我國海洋生物資源保護、開發的重點，開展藻類純化培養實驗的教師，也可通過日常教學中對于藻細胞周期等生理生化特征的觀察、純化等，發現具有重要生態、經濟價值的藻類物種，響應國家有關高校產學機制的政策，做到產學高效運行“兩不誤”。本研究中的三角褐指藻，即是一類具有重要生態、經濟意義的單細胞真核微藻硅藻的代表性藻種之一，在水產養殖、生物毒害檢測、活性物質開發等領域已被廣泛報道。與生物專業日常實驗教學中常用的微生物（細菌）特征類似，三角褐指藻具有微藻特征優勢，可作為一類重要的實驗材料。本研究結合傳統光學顯微鏡及血球計數板法，完成了對三角褐指藻單一細胞形狀的保種、接種量大小及生長階段觀察等方面的分析及優化，實驗結果可為日常生物實驗中有關單細胞藻類的培養與觀察方法的優化提供數據支撐，具有實踐意義。

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Abstract：Phaeodactylum tricornutum， one of the common species of seawater microalgae， has a variety of cell morphologies and unclear growth cycles of specific shaped cells during inculture. Combined wtih traditional optical microscopy and blood cell counting plate method，the analysis and optimization of the conservation of unicellular algae （diamond）， the determination of the optimal inoculum size， and the observation of the growth cycle were carried out in this study. The results show that isolation and counting of unicellular algae in this study are simple and easy to operate， which can provide data support for the optimization of algae cultivation and observation in daily biological experiments.

Key words：unicellular algae; phaeodactylum tricornutum; cell morphology; cell count; growth cycle