原人參二醇納米混懸液體外含量測定及凍干保護劑的研究

陳晨，孫倩

原人參二醇納米混懸液體外含量測定及凍干保護劑的研究

陳晨，孫倩

（遼寧醫藥職業學院， 遼寧 沈陽 110101）

20（S）-原人參二醇作為研究對象，用反溶劑沉淀法制備20（S）-原人參二醇納米混懸液。通過優化液相的條件，本章建立了原人參二醇HPLC的體外分析方法，確定了乙腈∶水（/）=90∶10（/）作為流動相，波長 210 nm 的液相條件。對標準曲線，精密度和準確度的考察結果顯示：原人參二醇在23.08~1 154 μg/mL范圍內線性良好，日內、日間精密度RSD值小于3%，準確度在96%~103%之間，加樣回收率為100.84%，該方法滿足體外檢測原人參二醇定量的要求。考察凍干保護劑，最后確定為1.5%的羥丙基-β-環糊精。

原人參二醇； 含量測定； 凍干保護劑

人參是五加科植物人參屬人參的干燥根莖，在我國應用歷史悠久，最早記錄于我國傳統醫學專著《神農百草經》[1, 2]。人參中有多種有效的化學成分，如皂苷、氨基酸揮發油及多糖等，其中人參皂苷類是人參的主要活性成分[3]。人參皂苷主要分以下三類[4, 5]：（1）、原人參二醇型，有Rb1, Rb2, Rb3, Rc,等；（2）、原人參三醇型，有R1, R2, R3, Rg等；（3）、齊墩果酸型，有Ro, Rh3, Ri等。研究表明，在胃腸道中，人參皂苷代謝成苷元或次苷元更好的表達藥理活性。

近年來，難溶性藥物原人參二醇（PPD）由于其抗腫瘤活性[6-8]和抗疲勞[9]，抗抑郁[10]等腦內活性近年來成為研究的熱點，但其溶解性差，生物利用度低限制其腦內活性的研究。據統計，約70%的有較強藥理活性的候選藥物由于水溶性差導致研發被迫中止[11]。現今已有很多方法解決難溶藥的溶解度問題，如添加增溶劑，形成包合物或絡合物等，但是這些技術局限于某些結構的化合物，如環糊精包合物需要分子大小與其中間的環狀結構契合。而把藥物制成納米晶混懸液是一種適合難溶藥制劑開發的新技術，納米晶具有載藥量為100 %，沒有納米粒聚合物載體材料[12]，可提高藥物的溶解度，進而提高藥物的生物利用度等優點。因此，可以通過制劑化手段改善PPD的生物利用度來提高其血藥濃度，針對PPD的理化性質，納米晶體混懸液給藥系統可望解決以上問題。

作者利用高效液相色譜法測定納米混懸液體外含量。實驗結果表明 ,該方法重復性良好，方便快捷。為日后20（S）-原人參二醇納米混懸液制劑的含量測定、質量控制提供了依據。

1 儀器與試料

高效液相色譜儀（Agilent 1200 Series）由四元泵、在線脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、二極管數組檢測器組成（Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA）；Zorbax SB-C18 色譜柱（4.6×250 mm, 5 μm，Agilent Technologies, Inc., Palo Alto, CA, USA）；恒溫磁力攪拌器（上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司，中國）； Nano-Zetasizer 動態光粒徑測定儀（Malvern，UK）；EL204-IC 電子天平（瑞 士 Mettler Toledo 公司）；Allegra X-15R 離心機（Beckman，USA）；冷凍干燥機（Coolsafe 110，Scanlaf，Denmerk）；

原人參二醇 （純度>98%,成都普菲爾生物技術有限公司），甲醇，乙腈（Merk，Germany）；維生素E聚乙二醇琥珀酸酯TPGS （Sigma-Aldrich）；丙酮購于天津凱通化學試劑公司；超純水。

2 實驗方法

2.1 原人參二醇納米混懸液的制備

精密稱取5 mg PPD溶解于1 mL丙酮中，在1 000 r/min條件下，注入到10 mL含0.015%（/）TPGS水相中，繼續高速攪拌5 min，超濾法除有機溶劑，高速離心25 min，用等體積超純水復溶，得到樣品PPD納米晶混懸液。

2.2 測定波長的選擇

配置PPD甲醇溶液200 μg/mL, 通過HPLC 1200 全波長掃描，確定高效液相色譜法中PPD的測定波長。

2.3 流動相的優化

色譜柱：Zorbax SB-C18（250×4.6 mm, 5μm, Agilent）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣體積：20 μL；檢測波長：210 nm；流動相：待優化。

2.4 標準曲線的繪制

精密稱定5.77 mg PPD樣品，甲醇溶解定容與5 mL 容量瓶中，得到濃度為1154 μg/mL 的PPD儲備液。分別用移液管精密量取儲備液，甲醇對半稀釋，得到 1 154, 577，288.5，115.4，57.7，23.08μg/mL的標準液。按照2.2項下優化的色譜條件進樣，PPD標準液的濃度（μg/mL）為橫坐標，HPLC峰面積為縱坐標，進行線性回歸，考察濃度與峰面積的線性關系。

圖1 PPD的全波長掃描圖

2.5 精密度和準確度考察

分別取線性范圍內的23.08, 284.48, 1 154 μg/mL高、中、低3個濃度的標準液，一天之內連續進樣5次，連續進樣3天，HPLC測定樣品。將峰面積帶入標準曲線，計算相應的標準液濃度，并與實際濃度進行比較，從而計算準確度，并且，以PPD測定濃度的相對標準偏差（RSD）評價日內與日間精密度。

2.6 穩定性試驗

精密吸取“2.3”項下任意濃度作為供試品溶液，放置24 h，每隔2 h按照2.2項下優化的色譜條件進樣3次，計算平均峰面積。

2.7 加樣回收率試驗

取已制備的PPD納米混懸液1 mL（約含PPD 0.5 mg），分別加入80%，100%，120% 已配制完的PPD對照品溶液（0.512 4 mg/mL），按照2.2項下優化的色譜條件依次進樣，平行測定3次，計算樣品中含量。

2.8 原人參二醇納米混懸液的凍干與重分散試驗

取已制備完的 0.4 mg/mL 的 PPD 納米晶混懸液，加入不同種類與濃度的凍干保護劑。樣品攪拌加入凍干保護劑溶解后，放入-80 oC 冰箱中預凍 12 h 以上， 后移入冷凍干燥機中凍干48 h以上，確保全部成為凍干粉。將凍干粉溶解于一定量超純水中獲得重分散體系。測定重分散后的混懸液的粒徑和 PdI，篩選 出具有良好分散性的凍干保護劑。凍干 PPD 納米晶混懸液候選保護劑如表1所示。

表1 不同種類凍干保護劑的濃度

3 結果與討論

3.1 測定波長的選擇

由HPLC1200得到原人參二醇在210~400 nm的全波長掃描圖，如圖1所示。

原人參二醇甲醇溶液在210 nm處有最大吸收，所以選擇210 nm作為HPLC方法中的檢測波長。

3.2 流動相的優化

調節乙腈與水的比例，得到的色譜結果如表2所示。實驗結果表明，隨著乙腈比例的增加，PPD的保留時間減小。為縮短分析時間，流動相比例確定為乙腈∶水（/）=90∶10 （/）。

表2 HPLC流動相比例優化

3.3 標準曲線的繪制

將PPD的濃度與對應的HPLC積分所得峰面積進行線性回歸，得到的回歸方程為：

=4.813 5-25.593（2=0.999 9）

式中：—積分所得峰面積；

—PPD濃度。

在23.08~1 154 μg/mL范圍內線性良好，標準曲線見圖2。

3.4 精密度和準確度的考察

該檢測方法高、中、低濃度準確度以及日內、日間準確度如表3。結果表明，日內、日間精密度的RSD值均小于3%, 準確度在96%~103%之間，說明所建立的高效液相色譜方法的精密度和準確度均良好。

圖2 PPD的標準曲線

表3 PPD的日間和日內準確度和精密度

3.5 穩定性試驗

結果表明，24 h內測定的RSD值為1.45%, 說明PPD甲醇溶液穩定性良好。

3.6 加樣回收率試驗

該檢測方法測定加樣回收實驗如表4。結果表明，加樣回收率為100.84%，RSD值＜3%，說明該高效液相色譜法的準確度良好。

表4 PPD的加樣回收率試驗

3.7 原人參二醇納米混懸液的凍干與重分散試驗

從實驗結果可見，凍干保護劑對PPD納米混懸液的凍干后重分散的影響不同。當加入乳糖和糊精在PPD納米混懸液凍干重分散時，有明顯沉降發生，無法復溶。當使用不同濃度的葡糖、D-海藻糖和0.5% 羥丙基-β-環糊精時，雖然可以使PPD納米混懸液重新分散，但是粒徑較大，且不均一。當使用1.5%和5%濃度的羥丙基-β-環糊精時，復溶后，粒徑沒有明顯變化，且PdI<0.3，體系較均一。在加入5%的羥丙基-β-環糊精時，由于濃度較高，在水中攪拌溶解時間較長。根據上述結果，因此最后確定以1.5%的羥丙基-β-環糊精作為PPD納米混懸液的凍干保護劑。

4 討論

本文曾以210 nm為波長，不同比例甲醇∶水作為流動相優化色譜條件，甲醇∶水=70∶30時，保留時間為29 min；甲醇∶水=80∶20時，保留時間為25 min；甲醇∶水=90∶10時，保留時間為18 min。嘗試用乙腈∶水作為流動相梯度洗脫，但是由于其基線不穩，漂移且出現平峰、拖尾等問題，而最終選擇以乙腈∶水=90∶10作為流動相，流速1 mL/min，效果較好。

［1］ Liu, C.X. and P.G. Xiao, Recent advances on ginseng research in China[J]., 1992，36（1）: 27-38．

［2］張均田. 人參研究的最新進展[J]. 江蘇大學學報（醫學版）, 2009, 19（03）: 185-191．

［3］Kitts, D. and C. Hu, Efficacy and safety of ginseng[J]., 2000, 3（4A）: 473-85．

［4］Choi, K.T., Botanical characteristics, pharmacological effects and medicinal components of Korean Panax ginseng C A Meyer[J]., 2008, 29（9）: 1109-18.

［5］張靜靜, 劉桂芹, 王慶鵬，李蘭杰. 植物三七中皂苷類化學成分的研究進展[J]. 聊城大學學報（自然科學版）, 2018, 31（02）: 43-52+59．

［6］Liu, G.Y., et al., 20S-protopanaxadiol-induced programmed cell death in glioma cells through caspase-dependent and -independent pathways[J]., 2007, 70（2）: 259-64.

［7］Zhang, Z., et al., TRAIL pathway is associated with inhibition of colon cancer by protopanaxadiol[J]., 2015, 127 （1）: 83-91．

［8］Zhu, G.Y., et al., 20（S）-Protopanaxadiol, a metabolite of ginsenosides, induced cell apoptosis through endoplasmic reticulum stress in human hepatocarcinoma HepG2 cells[J]., 2011, 668（1-2）: 88-98.

［9］Oh, H.A., et al., Anti-fatigue Effects of 20（S）-Protopanaxadiol and 20（S）-Protopanaxatriol in Mice[J]., 2015, 38（9）: 1415-9.

［10］Xu, H., et al., Protective effect of Panax quinquefolium 20（S）-protopanaxadiol saponins, isolated from Pana quinquefolium, on permanent focal cerebral ischemic injury in rats[J]., 2014, 7（1）: 165-170．

［11］Cooper, E.R., Nanoparticles: a personal experience for formulating poorly water soluble drugs[J]., 2010,141: 300-302.

［12］Junghanns, J.-U.A., M Li, S.L., Sun, E., Tan, X.B., Sechnology, drug delivery and clinical applications[J]., 3, 295.

Study on Determination of the In Vitro Content of Protopanaxadiol Nanosuspension and Its Lyophilized Protective Agent

,

（Liaoning Vocational College of Medicine, Liaoning Shenyang 113001, China）

Using 20 (S) -protopanaxadiol as research object, 20 (S) -protopanaxadiol nanosuspension was prepared by anti-solvent precipitation.An in vitro analytical method of protopanaxadiol by HPLC was established, and the liquid phase conditions were optimized as follows: the mobile phase acetonitrile and water(acetonitrile∶water=90∶10),the wavelength 210 nm.The standard curve, precision and accuracy were investigated. The results showed that the protopanaxadiol had good linearity in the range of 23.08~1 154 μg/mL,intra-day and inter-day precision RSD values were less than 3%,the accuracy was between 96%~103%, and the recovery rate was 100.84%.This method met the requirements for the in vitro determination of protopanaxadiol.At last,its lyophilized protective agents were screened, and 1.5% hydroxypropyl-β-cyclodextrin was finally determined as suitable lyophilized protective agent.

protopanaxadiol; content determination; lyophilized protective agent

2019-11-18

陳晨（1990-），女，助教，碩士，遼寧省沈陽市人，2016年畢業于澳門大學中藥學專業，研究方向：藥物分析。

孫倩（1985-），女，講師，碩士，研究方向：藥物分析。

O 657

A

1004-0935（2020）02-0140-04