藥品檢驗用計數培養基配制、滅菌及貯藏研究

戴宇婷 趙曉星 張金璽

作者單位：昭通市食品藥品檢驗所藥品微生物室，云南 昭通657000

微生物培養基是專供微生物生長繁殖使用的混合營養制品，一般都含有碳源、氮源、無機鹽以及生長因子和水等。作為科學研究和應用科學的重要支撐條件，發揮著其他手段不可替代的作用[1]。培養基質量是微生物學檢驗的基礎，其質量優劣可影響檢驗結果的準確性和可靠性[2]，培養基的配制、保存尤為重要[3]。為保證微生物生長、分離及鑒定等過程可靠，試驗結果準確，需保證所用培養基質量可靠、制備方法適宜、滅菌過程和貯藏條件等通過質量控制試驗。適宜的培養基制備方法、貯藏條件和質量控制試驗是提供優質培養基的保證[4-5]，本試驗通過對培養基配制、滅菌和貯藏進行驗證，使整個過程受控，通過定期的穩定性檢查確定了培養基的貯藏條件及貯藏期限，確保所配制的培養基可滿足藥品微生物檢查的要求。

1 材料與儀器

1.1 培養基

培養基（北京三藥科技開發公司）：胰酪大豆胨瓊脂培養基TSA、沙氏葡萄糖瓊脂培養基SDA、玫瑰紅鈉瓊脂培養基、R2A瓊脂培養基、胰酪大豆胨液體培養基TSB、沙氏葡萄糖液體培養基SDB，批號分別為：1612232、160913、150625、151215、160712、151102。中國食品藥品檢定研究院：R2A瓊脂對照培養基、沙氏葡萄糖瓊脂對照培養基、玫瑰紅鈉瓊脂對照培養基、胰酪大豆胨瓊脂對照培養基，批號分別為：135027-201401、135013-201502、135005-201404、135025-201603。

1.2 菌種

中國食品藥品檢定研究院：黑曲霉 [CMCC（F）98 003]、白色念珠菌 [CMCC（F）98 001]、金黃色葡萄球菌 [CMCC（B）26 003 ]、銅綠假單胞菌 [CMCC（B）10 104]、枯草芽孢桿菌 [CMCC（B）63 501]，傳代次數均未超過5代。

1.3 儀器設備

生化培養箱LRH-250F（上海一恒科技有限公司），恒溫水浴鍋HH-S24（金壇市大地自動化儀器廠），生物安全柜BHC-1300ⅡA2（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司），壓力蒸汽滅菌器YXQ-LS-75G（上海博迅實業有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 菌液制備 接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌至TSB中，35℃培養24 h；接種白色念珠菌至SDB中，25℃培養3 d；接種黑曲霉至SDA上，25℃培養7 d，用5 mL無菌0.9%氯化鈉溶液將孢子洗脫轉移至無菌試管內。取上述培養物，用無菌0.9%氯化鈉溶液制成每1 mL含菌或孢子數≤100 CFU的菌或孢子懸液，備用。

1.4.2 培養基的制備 根據各培養基包裝上的使用說明進行制備、分裝，置壓力蒸汽滅菌器中，121℃、0.14 MPa滅菌15 min。

1.4.3 培養基的貯藏 滅菌后的培養基2～8℃避光貯藏，貯藏效期30 d。滅菌后貯藏的凝固培養基，置于恒溫水浴鍋中沸水浴加熱（1次再融化），待培養基完全融化溫度降至不超過45℃使用。

1.5 監控項目

1.5.1 pH值測定 測定各培養基滅菌后的pH值（冷卻至室溫25℃測定）。試驗3次。

1.5.2 適用性檢査試驗 每一試驗菌株平行制備2個平皿。同時，用相應的對照培養基替代被檢培養基進行試驗，并做待檢培養基及對照培養基空白對照。取平均值。分別進行3次獨立試驗。

表1 pH值檢查結果

表2 胰酪大豆胨瓊脂培養基適用性檢査試驗結果

表3 沙氏葡萄糖瓊脂培養基、玫瑰紅鈉瓊脂培養基、R2A瓊脂培養基適用性檢査試驗結果

2 結果

各培養基pH值均未超過（規定值±0.2），均在規定范圍內（玫瑰紅鈉瓊脂培養基pH值未做要求）。菌液回收率=（被檢培養基上的菌落平均數/對照培養基上的菌落平均數）×100%。回收率均在50%～200%范圍內。且被檢培養基上的菌落形態大小與對照培養基上的菌落一致，陰性對照試驗均無菌生長。見表1、表2和表3。

3 討論

3.1 人員操作

檢查過程中任何檢查程序出現操作不當[6]，都將影響結果的準確性。本試驗進行的3次操作分別由接受過相關培訓的不同試驗人員獨立按照標準操作程序進行，確保將人員對試驗影響降到最低[7]。

3.2 培養基的選擇

與2010版藥典相比，2015年版中國藥典對微生物限度檢查的潔凈環境、培養基及檢查方法進行了修訂[8]，修訂后的微生物限度檢查方法與歐美藥典基本一致[9]。其中計數培養基將營養瓊脂、玫瑰紅鈉瓊脂培養基和酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養基，修訂為胰酪大豆胨瓊脂培養基、沙氏葡萄糖瓊脂培養基和玫瑰紅鈉瓊脂培養基；并在工藝用水微生物限度計數中，引入了R2A瓊脂培養基[10]。玫瑰紅鈉瓊脂培養基因其具有的選擇性，仍然保留作為當沙氏葡萄糖瓊脂培養基上生長的細菌使霉菌及酵母菌的計數結果不符合微生物限度要求時使用的備選培養基之一[11]。

3.3 滅菌操作

滅菌設備及參數對培養基有較大影響，本試驗采用濕熱滅菌法，所使用的高壓滅菌器經過性能確認，并定期檢定及驗證；滅菌參數均嚴格按照各培養基的使用說明進行設定為溫度121℃、壓力0.14 MPa，滅菌15 min。保證培養基中營養成分不被破壞，避免培養基中其他物質因高溫發生反應而影響其質量[12]。

3.4 不同培養基的適用性檢查

市場上脫水培養基廠家很多，廠家不同、批號不同，對培養基的質量有顯著影響。更換生產商，需重新進行驗證。根據《中國藥典》2015年版四部（9203）規定，通過本次驗證試驗，培養基的整個配制、滅菌過程受控，每一個批號的脫水培養基只需進行一次適用性檢查，更換其他批號培養基也需重新進行驗證。

3.5 貯藏條件

2～8℃、避光，所用醫用冷藏箱定期校驗，只再融化1次并未對培養效果造成明顯影響。若培養基貯藏條件改變需另行驗證貯藏條件、貯藏效期等。

綜上所述，據試驗結果，各培養基根據其包裝上的使用說明制備，121℃、0.14 MPa滅菌15 min，培養基的pH值及適用性檢查均符合規定，在試驗貯藏期限30 d內符合規定。