RXFP2 在己烯雌酚染毒小鼠睪丸引帶細胞中的作用機制研究*

段守興 蔣學武 張冰娜 肖文峰 謝新泉 張 鏇** 李建宏**

1. 汕頭大學醫學院第二附屬醫院小兒外科（廣東汕頭 515041）；

2. 南方醫科大學附屬深圳坪山婦幼保健院小兒外科（廣東深圳 518122）；

3. 汕頭大學醫學院第一附屬醫院小兒外科；

4. 汕頭大學醫學院第二附屬醫院轉化醫學研究中心

隨著社會的進步與發展，工業化程度不斷提高，人類在征服改造自然取得輝煌成就的同時， 由此導致環境污染與生態失衡對人類健康， 尤其是生殖健康造成嚴重的影響[1-4]，這可能與孕期暴露環境雌激素（environmental estrogens，EEs）密切相關[5-7]。 環境雌激素對人類雄性生殖健康的影響主要表現在男性先天性畸形如隱睪、尿道下裂、性別發育異常（DSD）等以及成年后生殖、性功能異常，生殖系腫瘤等[8-10]。 睪丸作為生殖系統的核心器官， 它影響或誘導整個雄性生殖系統的發育，使得深入研究睪丸正常下降發育的影響因素尤為重要。

睪丸的正常發育需經歷兩個正常的下降階段，在睪丸下降第一階段（經腹下降期），睪丸引帶特征性地表現細胞增殖、分化、遷移、收縮及激素代謝等功能[11]。目前公認在睪丸下降發育第一階段起關鍵作用的調控因子——胰島素樣因子3（Insulin-Like Factor 3，INSL3）能刺激睪丸引帶增生，控制其生長發育[12-14]。INSL3 通過與其特異受體松弛素家族肽受體2（Relaxin fam ily peptide receptor 2,RXFP2）結合形成INSL3-RXFP2 配體受體復合物發揮生物學作用[15,16]。 既往研究發現EEs 可不同程度的抑制胚胎期睪丸Leydig 細胞生成INSL3，從而影響睪丸下降發育， 并推測這個過程是進一步影響睪丸引帶的形態及功能間接實現的[17]。 但EEs 對睪丸引帶發育影響的確切作用機制卻并不十分清楚。 目前EEs 對INSL3 影響方面的研究已有不少報道[13,18]，但對其特異性受體RXFP2 是否有直接影響的報道尚缺乏。

為了明確EEs 影響睪丸引帶發育是否與RXFP2 直接相關。 本研究利用經典EEs 己烯雌酚（diethylstilbestrol，DES）進行染毒，觀察DES 對培養的小鼠睪丸引帶細胞形態、增殖性和RXFP2 的影響，探討RXFP2 在外源性雌激素影響小鼠睪丸引帶發育中的可能作用機制，為闡明EEs 的生殖毒性作用機制提供新的理論依據。

材料與方法

一、材料

（一）實驗動物

8～10 周齡昆明小鼠購自并飼養于汕頭大學醫學院實驗動物中心（SPF 級別）。按雌雄比例2∶1 合籠，懷孕生產后取新生仔鼠用于實驗。

（二）主要試劑

DES（美國Sigma 公司）；高糖不含酚紅的DMEM（德國Applichem 公司）；不含雌激素的胎牛血清（以色列Biological 公司）； DMSO （中國上海生工）；CCK-8（日本Dojindo 公司）；臺盼藍（美國Sigma 公司）；DAPI（中國碧云天公司）； 山羊抗小鼠RXFP2 多克隆抗體（美國Santa Cruz 公司）；異硫氰酸熒光素(FITC)一兔抗山羊IgG（中國武漢博士德生物工程有限公司）。

（三）主要儀器

手術放大鏡（中國天津醫學光學儀器廠）；手術顯微器械（中國上海金鐘手術器械廠）；倒置顯微鏡（德國Leica 公司）；熒光顯微鏡（德國Leica 公司）；ELx800 酶標儀（美國Bio-Tek 公司）；凝膠成像系統（美國UVP 公司）。

二、方法

（一）小鼠睪丸引帶細胞的培養及分組

脫頸椎處死新生小鼠， 在3 倍手術放大鏡下取出小鼠睪丸引帶組織。 將引帶組織放入含Ⅰ型膠原酶（1mg/m L）的DMEM 培養液中，37 ℃持續振蕩消化1h 后，加入3～4 倍含無雌激素血清的培養液終止消化作用； 靜置后取上清液， 用25μm 孔徑過濾器過濾，以1 000 r/m in 離心濾液5 m in（離心半徑為15 cm），棄上清。 細胞沉淀加入含無雌激素胎牛血清（體積分數為10%）的DMEM 培養液，吹打成單細胞懸液，接種于25 m L 培養瓶中， 置于5% CO2、37 ℃飽和濕度孵育箱中靜置培養。 傳代細胞隨機分為正常組、溶劑對照組和實驗組（DES 0.01、0.10、1.00、10.00 μg/m L 4 個劑量組）。

（二）小鼠睪丸引帶細胞計數及存活率的檢測

對細胞傳代時的細胞懸液進行計數。 用酒精沖洗計數板后，把蓋片覆在計算板上，取少許混勻的細胞懸液加入計數板和蓋片間的間隙中， 置相差顯微鏡下觀察，可見細胞均勻分散于各處。 計算四角大格內的細胞數，壓中線者只計左側和上方者，右方和下方不計算在內。 然后按下式計算：細胞懸液濃度（細胞個數/m L）≈（4 個大方格細胞總數/4)×10 000×稀釋倍數。

用臺盼藍染細胞時，活細胞拒染，死細胞可攝取染料變藍。 利用細胞這種特性，我們使用臺盼藍對傳代的細胞懸液進行細胞活性檢測。 取混勻的細胞懸液和0.2%臺盼藍（9∶1）充分混合，置2～3m in。 取10μl 細胞懸液后加入至計數板與蓋片間的間隙中。 置倒置顯微鏡下觀察，凡著色的細胞均為不健康的或已死細胞，活細胞不著色。 計算四角大格內的細胞數（同細胞計數）然后按下式計算： 細胞活性（%）≈[活細胞數/（活細胞數＋死細胞數）]×100%

（三）CCK-8 法細胞增殖抑制檢測

將制備好的細胞懸液種于96 孔板中（邊緣一圈不接種），每組設9 個平行孔，重復3 次。 實驗組加入不同劑 量 的DES （終 濃 度 分 別 為0.01、0.10、1.00、10.00 μg/m L）各1 μl，溶劑對照組加入DMSO1 μl，正常組不加任何藥物。 加藥后48 h 進行CCK-8 的檢測。 每孔加入10 μl 的CCK-8 后，避光置于37 ℃培養箱中孵育1 h。使用酶標儀雙波長（檢測波長為450 nm 和630 nm）測定每孔的吸光度值，以代表細胞的增殖性。

（四）細胞免疫熒光檢測

選擇傳代1～2 d、長滿單層、形態良好的細胞，去除培養基，分別加入終濃度為0 （溶劑對照）、0.01、0.10、1.00、10.00 μg/m l 含DES 的培養液1 μl， 并設正常對照（不加任何藥物）。 繼續培養48 h 后，將獲取的細胞蓋玻片用PBS 輕洗，4%多聚甲醛固定15 min，PBS 輕洗3 遍，1%BSA 覆蓋片刻， 滴加濃度為1∶100 的山羊抗小鼠RXFP2 多克隆抗體（一抗），置濕盒內4℃過夜，再用PBS 輕輕洗滌3 遍后，滴加1∶500 FITC- 兔抗山羊IgG（二抗），在室溫中孵育60m in ，PBS 輕輕洗滌3 遍，加入DAPI 染核5 min。 甘油封片，熒光顯微鏡下觀察,拍片。

（五）Western Blot 分析

取各組睪丸引帶細胞加入RIPA 蛋白酶裂解后取上清液獲取蛋白， 取一定的蛋白量進行SDS-PAGE 電泳，硝酸纖維素膜轉膜，脫脂奶粉封閉，一抗山羊抗小鼠RXFP2 多克隆抗體（1∶100）在4℃冰箱內過夜孵育，二抗（HRP 一兔抗山羊IgG 1：500） 室溫下孵育1～2 h后，進行化學發光反應，顯影，定影。 最后將膠片進行掃描或拍照， 用Image-pro 軟件分析目標條帶光密度值。以測定蛋白灰度值與內參蛋白灰度值的比值表示其蛋白相對表達水平，實驗重復3 次，取其平均值。

三、統計學分析

所有數據均以x±s 表示，應用SPSS17.0 統計軟件分析，樣本率采用卡方檢驗，多組比較采用方差齊性檢驗和單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間兩兩比較時，采用兩獨立樣本t 檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

一、DES 對小鼠睪丸引帶細胞形態的影響

正常組與溶劑對照組培養的小鼠睪丸引帶細胞大部分為成纖維樣細胞，有少數的上皮樣細胞。 胞體呈梭形或不規則三角形，胞質有突起（圖1 A,B）。 實驗組細胞隨DES 劑量增加明顯受抑制，細胞生長緩慢，突起回縮，相互間隙增大（圖1 C,D,E,F）。 DES 劑量越高，細胞越失去成纖維細胞的形態，細胞漿收縮，胞體呈不規則類橢圓型（圖1 F）。

圖1 DES 對小鼠睪丸引帶細胞形態的影響

二、DES 對小鼠睪丸引帶細胞增殖性的影響

正常細胞傳代后仍呈成纖維細胞型生長， 同源性好，存活率可達90%。各實驗組隨DES 劑量增加細胞數及細胞生存率均下降（P＜0.001）(圖2 A)。正常組細胞呈持續性增殖，溶劑對照組無明顯差異。 實驗組與正常組對比均有不同程度的增殖抑制(P＜0.05 或P＜0.001)，以DES 10 μg/m l 組抑制最明顯（P＜0.001）(圖2 B)。 表明DES 對睪丸引帶細胞增殖性有抑制作用，并存在劑量-效應關系。

圖2 DES 對小鼠睪丸引帶細胞生長及增殖情況的影響

三、RXFP2 的亞細胞定位及DES 對小鼠睪丸引帶細胞RXFP2 表達的影響

我們使用細胞免疫熒光方法顯示RXFP2 表達于細胞膜上，熒光強度較高（圖3）。 通過Western Blot 結果發現正常組和溶劑對照組小鼠睪丸引帶細胞上的RXFP2 表達無明顯差異（P＞0.05），各實驗組中RXFP2表達明顯降低（P＜0.001）（圖4）。

圖3 免疫熒光對RXFP2 的亞細胞定位

圖4 Western Blot 檢測DES對小鼠睪丸引帶中RXFP2 表達的影響

討 論

環境雌激素又稱外源性雌激素， 是人體外化學物質中具有雌激素樣活性， 并可破壞人體內分泌平衡引起一系列臨床后果的物質， 廣泛存在于自然界和人們的日常生活中[6,19]。無論動物實驗還是流行病學方面的研究都顯示EEs 能引起多種泌尿生殖系統異常/畸形[20,21]。美國國家環境衛生科學研究所 （National Institute of Environmental Health Sciences）的實驗室將DES 作為用來研究EEs 效應的參考雌激素[22]。 因此， 本研究選擇DES 作為我們研究EEs 生殖毒性的干預手段。

小鼠睪丸下降第一階段（經腹下降期）發生于胎鼠期，睪丸引帶在此階段特征性地表現細胞增殖、分化、遷移、收縮及激素代謝等功能，引帶細胞收縮活性與引帶形態變化相互協調[23]。我們對培養的小鼠睪丸引帶細胞進行單一的干預因素作用， 發現DES 可致小鼠睪丸引帶細胞形態異常、結構紊亂，隨著DES 劑量的增加，細胞失去原有形態，并與劑量有關。提示DES 對小鼠睪丸引帶細胞有顯著的細胞毒性作用， 可以抑制小鼠睪丸引帶細胞的生長與發育。

睪丸下降發育是一項非常復雜的系統工程， 要經歷兩個下降過程， 涉及很多影響或調控睪丸下降發育的因素[24,25]。目前已比較明確的是INSL3 在睪丸下降的第一階段起著決定性作用，INSL3 與RXFP2 結合形成受體配體復合物INSL3-RXFP2 發揮生物學效應[15,16]。我們確定了DES 對小鼠睪丸引帶發育的影響， 但具體的作用機制仍不清楚[26]。

通過本研究，我們發現RXFP2 高表達于睪丸引帶中，并主要分布在細胞膜上。 DES 作用后RXFP2 蛋白表 達 降 低，DES 劑 量 越 大，RXFP2 表 達 越 低。 由 于RXFP2 是睪丸下降發育第一階段關鍵調控因素INSL3的特異性受體，且兩者需形成INSL3-RXFP2 復合物方可發揮生物學效應[15,16]。 RXFP2 表達量的降低將使得INSL3 減少了發揮生物效應的媒介，減少了相互結合，從而使睪丸經腹下降期受阻[27]。因此，我們推測DES 對睪丸引帶細胞形態及增殖性的影響可能是通過RXFP2起作用，提示RXFP2 可能介導了DES 影響睪丸引帶發育的過程。

綜上所述， 通過本研究我們驗證了DES 可引起小鼠睪丸引帶細胞形態與增殖異常， 并進一步檢測了DES 可以降低睪丸引帶中RXFP2 的表達。 提示DES對睪丸引帶的影響可能是通過RXFP2 信號系統介導的， 為更全面地研究外源性雌激素影響生殖系統發育的可能途徑提供理論基礎。