RhoA 信號通路與海綿體神經(jīng)損傷性ED 的相關(guān)研究進(jìn)展*

葉妙勇，趙 凡 馬 軻 周 康 呂伯東(審校)

1. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院（杭州310053）；2.溫嶺市第一人民醫(yī)院泌尿外科（溫嶺317500）；3. 南通大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科/男科（南通226001）；4. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院泌尿男科（杭州310005）；5. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)泌尿男科研究所/浙江省中醫(yī)藥男科重點實驗室（杭州310053）

隨著醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)的不斷發(fā)展， 早期前列腺癌（Prostatic cancer，PCa）的確診率不斷升高，且患者人群趨于年輕化， 研究報告顯示PCa 目前在男性惡性腫瘤發(fā)病率中高居第2 位，前列腺癌根治術(shù)（Radical prostatectomy，RP）仍是臨床治療早期PCa 的首選策略[1]。 但是，即使腔鏡手術(shù)甚至機(jī)器人輔助腔鏡手術(shù)技術(shù)得以發(fā)展，鑒于陰莖海綿體神經(jīng)（Cavernous nerve，CN）的解剖位置，仍很難避免在RP 中對其造成損傷，CN 損傷會直接導(dǎo)致患者勃起功能（erectile function，EF）顯著下降，而恢復(fù)期則需18 個月甚至更久[2]。 目前臨床用于治療ED的一線口服藥物5 型磷酸二酯酶抑制劑（Phosphodiesterase type 5 inhibitor，PDE5i）總體有效率為60～70%[3]，超過1/3 的患者對于PDE5i 不敏感甚至不應(yīng)答，而PDE5i 對于CNIED 的療效仍存在爭議[4,5]，RP （CN 損傷）后如何維持或改善患者的勃起給泌尿男科醫(yī)師帶來挑戰(zhàn)，CNIED 的發(fā)病機(jī)理及治療策略亟待進(jìn)一步探索。

以往大多數(shù)針對陰莖勃起調(diào)控機(jī)理的研究將關(guān)注點落在一氧化氮（Nitric oxide，NO）介導(dǎo)的海綿體舒張作用[6]。 而2001 年，Chitaley K 等[7]在《Nature Medicine》雜志首次報道RhoA 信號通路對陰莖海綿體平滑肌的收縮功能起到重要調(diào)控作用，靶向抑制RhoA 信號可有利于勃起，這為ED 的治療帶來了新的思路。近年來，諸多學(xué)者在研究不同類型的ED 中均發(fā)現(xiàn)RhoA 信號上下游關(guān)鍵蛋白分子的變化，而其在CNIED 中的病理生理進(jìn)程中同樣扮演了不容忽視的角色[8]。 故本文擬結(jié)合近幾年的相關(guān)報道， 對RhoA 信號通路與CNIED 的關(guān)系及其研究進(jìn)展作一綜述。

一、CNIED 的病因

CN 屬于外周神經(jīng)， 其神經(jīng)纖維發(fā)自盆腔神經(jīng)叢，位于腹膜后的直腸外側(cè)， 緊鄰前列腺背外側(cè)的精囊頂端， 走行于前列腺和腹側(cè)筋膜之間。 因小動靜脈伴行CN 大部分走行軌跡，故形成神經(jīng)血管束（Neurovascular bundle，NVB）。 當(dāng)NVB 在某些情況下受傷后，CN 失用（neuropraxia） 會導(dǎo)致陰莖缺氧并破壞陰莖海綿體平滑肌結(jié)構(gòu)和功能[9]。

目前認(rèn)為CNIED 的病因主要包括非醫(yī)源性和醫(yī)源性。 非醫(yī)源性損傷主要指骨盆骨折等外傷導(dǎo)致的腹部深層CN 損傷、 或具有調(diào)控CN 功能的上游中樞神經(jīng)系統(tǒng)和脊髓出現(xiàn)病變以及糖尿病所致CN 病變等。而醫(yī)源性損傷是CNIED 最為常見的致病因素， 前列腺癌、膀胱癌、結(jié)直腸癌等盆腔腫瘤根治性手術(shù)過程中，牽拉、鉗夾、冷凍、離斷、切除等對CN 造成的直接或間接損傷均可造成患者術(shù)后勃起功能呈 “斷崖式”的降低，CN 受損后患者夜間快速動眼期自主勃起明顯減少甚至喪失，且在接受性刺激后勃起反應(yīng)亦明顯減弱[2]；腫瘤放射性治療（radiation therapy，RT）亦會造成CN 損傷，如患者在接受前列腺癌放射治療時，早期RT 對勃起的負(fù)面影響并不顯著，但由于持續(xù)性RT 會對CN 造成慢性損傷，勃起功能會呈現(xiàn)出“漸退式”的下降。

二、RhoA 信號及其與NO/cGMP 間的“交互作用”

1.RhoA 與Rho 激酶

Rho 屬于G 蛋白Ras 超家族小分子單體， 其亞型主要包括RhoA、RhoB、RhoC， 三者氨基酸同源性高達(dá)80%。 但相比RhoB 和RhoC，RhoA 具有更獨特的生物學(xué)調(diào)控作用， 其可直接介導(dǎo)肌球蛋白磷酸酶活性并參與平滑肌的收縮[10]，此外，RhoA 還參與調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)、骨架、分化及基因轉(zhuǎn)錄等。 RhoA 是小分子GTP 結(jié)合蛋白之一， 可介導(dǎo)GTP 活性， 與其他GTP 酶作用相似。RhoA 蛋白的活化與鳥嘌呤核苷酸交換因子（RhoGEF）、GTPase 活化蛋白 （GAP） 及鳥嘌呤核苷酸抑制因子（RhoGDI）三者存在著密切的關(guān)聯(lián)[6]。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)RhoA 蛋白與GDP 結(jié)合時處于非活化狀態(tài)，與GTP 結(jié)合后可于細(xì)胞膜活化。 非活化狀態(tài)下，RhoGDI 與RhoA-GDP 結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合體，并將該復(fù)合體“錨定”位于細(xì)胞質(zhì)；而RhoGEF 則有助于RhoA 脫離GDP 和RhoGDI，繼而轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上與GTP 結(jié)合形成活化的RhoA-GTP 復(fù)合體。RhoA-GTP 復(fù)合體進(jìn)而激活下游的Rho 激酶，啟動RhoA/Rho 激酶途徑。

Rho 激酶（Rho-associated kinase，ROCK）分子量約為160kDa，屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，1996 年被證實為小分子RhoA-GTP 的重要下游因子[10]。 ROCK 是目前功能研究最為詳細(xì)的RhoA 下游靶向分子， 包括ROCK-1（ROKβ） 和ROCK-2 （ROKα） 兩種亞型，ROCK-1 和ROCK-2 在體內(nèi)器官組織中具有表達(dá)差異性，在細(xì)胞中發(fā)揮的作用也不盡相同[11]。 平滑肌組織中RhoA 活化后進(jìn)而激活ROCK， 促進(jìn)MLCP 磷酸化后介導(dǎo)了平滑肌收縮[6]，目前認(rèn)為RhoA/ROCK 信號是防治CNIED 的潛在靶點。

2.RhoA 與NO/cGMP 信號的“交互作用”

Chitaley 等[7]于2001 年在大鼠中首次證實了RhoA/Rho 激酶信號通路與陰莖海綿體平滑肌收縮作用有關(guān)， 提出其對勃起的抑制作用獨立于NO 信號。 RhoA信號通過Ca2+增敏途徑調(diào)節(jié)陰莖海綿體平滑肌處于收縮狀態(tài)，Ca2+介導(dǎo)肌球蛋白輕鏈激酶的活化后可進(jìn)而激活ROCK。

但是后續(xù)的研究表明NO 與RhoA/Rho 激酶通路之間存在著復(fù)雜的“交互作用（cross talk）”。 NO 在陰莖勃起中主要介導(dǎo)CCSMCs 及血管舒張， 由一氧化氮合酶（NOS）合成。 NOS 包括3 種同型二聚體：內(nèi)皮源型（eNOS）、 神經(jīng)源型 （nNOS） 及誘導(dǎo)型 （iNOS），經(jīng)NO/cGMP/PKG 通路參與陰莖勃起反應(yīng)。 而RhoA/Rho激酶對NO 信號存在負(fù)性調(diào)控，主要通過抑制eNOS 表達(dá)使NO 表達(dá)減弱。 M ing 等[12]對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞過表達(dá)RhoA 后抑制了eNOS 磷酸化，同時降低其mRNA穩(wěn)定性，抑制了NO 合成。 Bivalacqua 等[13]在鏈脲菌素（STZ） 誘導(dǎo)的糖尿病ED 大鼠中轉(zhuǎn)染抑制RhoA 表達(dá)的相關(guān)腺病毒， 證實RhoA/Rho 激酶通路調(diào)控eNOS，降低陰莖海綿體中NOS 活性與cGMP 水平。 另一方面，NO 對RhoA/Rho 激酶信號的調(diào)控具有 “兩面性”，有學(xué)者在大鼠血管平滑肌細(xì)胞中使用8- 溴-cGMP 和硝普鈉激活PKG， 導(dǎo)致RhoA 在Ser188 位點磷酸化后轉(zhuǎn)為失活狀態(tài)[14]， 說明NO 亦具有抑制RhoA 信號作用；而也有報道稱，當(dāng)大鼠動脈中NO 被L-NAME 抑制時RhoA 蛋白和mRNA 表達(dá)均減少，相反，當(dāng)予以硝普鈉時RhoA 蛋白和mRNA 表達(dá)均增加[15]。 針對NO 與RhoA/Rho 激酶信號之間的復(fù)雜互作關(guān)系，有學(xué)者運用我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)理論的“陰陽學(xué)說”結(jié)合二者分別調(diào)控陰莖海綿體平滑肌舒張和收縮的作用進(jìn)行了描述， 認(rèn)為NO 信號類似于“陽”，促進(jìn)了勃起；而RhoA 信號類似于“陰”，抑制了勃起，其之間存在著“陰陽”的“對立制約”或“此消彼長”，但在某些情況下又會呈現(xiàn)出“相互轉(zhuǎn)化”會“互根互用”[16]。 筆者認(rèn)為這種描述既形象，又很好地概括了兩種信號的關(guān)系。

三、RhoA 信號在CNIED 中的研究進(jìn)展

1.RhoA/ROCK 與陰莖海綿體組織

為明確兩種Rho 激酶亞型與ED 的關(guān)系，Pieter等[17]首次開展了臨床研究，該團(tuán)隊收集了21 例不同病因所致重度ED 患者（均對PDE5 抑制劑不應(yīng)答，擬行陰莖假體植入術(shù)）的陰莖海綿體組織，進(jìn)而與5 例勃起功能正常的志愿者（前列腺腺瘤患者，因急性尿潴留擬經(jīng)尿道剜除腺瘤） 的陰莖海綿體組織進(jìn)行檢測分析及對比，免疫組織化學(xué)檢測圖像顯示ROCK 與α- 平滑肌肌動蛋白在組織中定位吻合， 確認(rèn)了ROCK 在人海綿體平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)， 兩組海綿體組織中ROCK-1 mRNA 表達(dá)無明顯差異（P＞0.05），而ROCK-2 的相對表達(dá)量在重度ED 組顯著提高 （7570±3013 vs 2924±432；P＜0.05），故推測ROCK-2 特異性抑制劑可能對上述難治型ED 的治療更有效。但是該研究局限性在于臨床中獲取海綿體組織樣本難度較大、且標(biāo)本數(shù)量有限，因此該研究僅使用qPCR 檢測了ROCK mRNA， 而無法進(jìn)一步檢測其蛋白含量， 所測得的數(shù)據(jù)亦無法就ROCK 壓型與CNIED 的關(guān)系予以分析。

利用動物構(gòu)建CNIED 病理模型是目前用來研究其發(fā)病機(jī)制及潛在治療策略的主流方法，大鼠CN 可被精確地定位、分離，并對其人為造成匹配實驗所需的各種類型或程度的損傷， 故諸多學(xué)者即利用大鼠CNIED模型對Rho 激酶亞型與CNIED 相關(guān)性進(jìn)行探索[18]。 早期研究表明ROCK-2 表達(dá)升高在CNIED 病理生理機(jī)制中起主要作用， 但是后續(xù)亦有研究證實ROCK-1 的高表達(dá)與CN 損傷性ED 密切相關(guān)[19-24]目前， 對于ROCK-1 與ROCK-2 在介導(dǎo)CNIED 發(fā)病機(jī)制方面存在爭鳴 （具有代表性的研究報告見文末表格圖）。 如Gratzke 等[19]使用5 號手術(shù)鑷在距離盆神經(jīng)節(jié)（Major pelvic ganglion，MPG）2 ～3mm 處對大鼠雙側(cè)CN 施行夾損，參數(shù)為15 秒/次、共計3 次，以期造成中度的CN損傷，14 天后檢測發(fā)現(xiàn)，陰莖組織和背神經(jīng)中nNOS 蛋白表達(dá)顯著下降， 且RhoA 和ROCK-2 蛋白表達(dá)增加（P＜0.05）， 而ROCK-1 表 達(dá) 變 化 不 顯 著（P＞0.05）。Gratzke 等[19]認(rèn)為CN 損傷后RhoA 信號激活介導(dǎo)了ROCK2 蛋白過表達(dá)，進(jìn)而對陰莖血流動力學(xué)造成負(fù)面影響， 而RhoA/ROCK2 信號的強(qiáng)表達(dá)可能是CN 損傷后陰莖組織缺氧及活性氧含量升高介導(dǎo)的。 不同的是，Cho 等[20]通過兩種方式構(gòu)建CN 損傷大鼠模型，一種是在距MPG5mm 處利用顯微外科血管夾進(jìn)行夾損，參數(shù)設(shè)置為30s(+)—30s(-)—30s(+)；另一種則是在距MPG 5mm 處直接離斷CN。 分別于術(shù)后1 周和8 周進(jìn)行檢測， 結(jié)果顯示術(shù)后兩種模型大鼠陰莖海綿體組織中平滑肌/膠原含量比均明顯下降，1 周時夾損和離斷組大鼠海綿體中RhoA 蛋白表達(dá)均顯著升高，但僅離斷組大鼠海綿體中ROCK-1 蛋白顯著升高；術(shù)后8 周時，兩種模型海綿體組織中RhoA/ROCK-1 信號均明顯增強(qiáng)。該團(tuán)隊認(rèn)為CN 損傷所致海綿體纖維化上調(diào)了RhoA/ROCK-1 信號。 另外值得說明的是，筆者發(fā)現(xiàn)該團(tuán)隊主要專注于CN 損傷后RhoA/ROCK-1 信號的變化，雖然在另外一篇報道中該團(tuán)隊在研究局限性中指出未測ROCK-2，但縱觀其相關(guān)研究筆者暫未發(fā)現(xiàn)ROCK-2 研究數(shù)據(jù)。 因此，Cho 等的研究僅表明在其團(tuán)隊夾損參數(shù)設(shè)置下可以造成大鼠海綿體中RhoA/ROCK-1 信號增強(qiáng)，但不能排除ROCK-2 表達(dá)升高的情況。

綜上，結(jié)合筆者團(tuán)隊的研究，現(xiàn)認(rèn)為CN 損傷可以介導(dǎo)大鼠海綿體組織中RhoA 信號增強(qiáng)，且其下游分子ROCK-1 和ROCK-2 均會過表達(dá)。筆者考慮實驗過程中CN 損傷動物模型構(gòu)建方法的差異、 實施實驗者的操作、實驗觀察周期等不同設(shè)置均可能導(dǎo)致結(jié)果的差異，然而生物體的復(fù)雜性亦對上述不同的結(jié)局帶來了必然性。 筆者認(rèn)為在規(guī)范化的操作步驟下，設(shè)置不同的CN損傷方式、 不同的實驗觀察點， 可有助于更好地評估ROCK 亞型在CNIED 的動態(tài)變化。

表1 ROCK 亞型與CNIED 的代表性研究（注：“↑”表示顯著增加，“-”表示無明顯變化）

2.RhoA/ROCK 與CN 損傷修復(fù)

PDE5i 是目前臨床治療ED 的一線口服藥物，但其主要作用于陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞發(fā)揮作用， 且目前PDE5i 對CNIED 的療效仍存在爭議。 筆者認(rèn)為，CNIED 的治療不能局限于陰莖本身， 亦應(yīng)針對如何促進(jìn)CNI 的修復(fù)予以探索。 現(xiàn)已有研究表明RhoA 信號的增強(qiáng)卻會抑制周圍神經(jīng)再生[25-27]。

RT 對CN 造成的慢性損傷中存在ROCK 的表達(dá)持續(xù)增強(qiáng)，Mahmood 等[28]對大鼠的前列腺區(qū)域采用25Gy 劑量照射后，9 周與14 周后解剖獲取MPG，檢測發(fā)現(xiàn)其中RhoA 與ROCK-1 的蛋白和mRNA 表達(dá)上調(diào)，而ROCK-2 變化不明顯。Hannan 等[26]在研究中發(fā)現(xiàn)CN 損傷造成MPG 中RhoA/ROCK 通路活化， 繼而促進(jìn)了凋亡及氮能神經(jīng)功能失常（nitrergic dysfunction），而ROCK-1 抑制劑（Y-27632）可有效抑制MPG 中nNOS陽性軸突的caspase-3 依賴性凋亡、nNOS 解偶聯(lián)，抑制ROCK-1 后促進(jìn)了離體培養(yǎng)MPG 神經(jīng)突的再生，維持了氮能神經(jīng)介導(dǎo)的勃起及陰莖海綿體的舒張。 因此，Hannan 等認(rèn)為ROCK-1 可作為保護(hù)軸突對陰莖的自主神經(jīng)支配治療靶點。

此外， 筆者團(tuán)隊認(rèn)為CNIED 的致病之源乃CN 損傷，CN 損傷屬于周圍神經(jīng)損傷， 從中醫(yī)學(xué)角度而言存在“氣虛血瘀”的基本病機(jī)，因此主張以益氣活血為基本治法[29]。 而在進(jìn)一步的實驗研究中，我們也證實益氣活血方藥在促進(jìn)CN 損傷修復(fù) （數(shù)據(jù)未發(fā)表） 及抑制RhoA/ROCK2 信號[30]方面可起到顯著的作用，這與中藥促進(jìn)周圍神經(jīng)再生的性能是相符合的[31]。

3.中醫(yī)藥對RhoA/ROCK 的調(diào)控作用

筆者所在團(tuán)隊目前的學(xué)術(shù)方向之一及CNIED 的發(fā)病機(jī)理及中醫(yī)藥防治研究， 目前已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，我們發(fā)現(xiàn)益氣活血類方藥可以有效改善CNIED，同時， 也顯示出對CN 損傷后大鼠海綿體組織中RhoA/ROCK-2 信號的抑制作用[30]。 實際上，鑒于中藥及復(fù)方的多靶點、多效應(yīng)特點，已有諸多學(xué)者報道中藥制劑對RhoA/ROCK 信號的調(diào)控作用。 如宋純東等[32]研究發(fā)現(xiàn)，菟絲子、生黃芪、積雪草、生地黃、水蛭及大黃組成的益腎活血復(fù)方可以顯著下調(diào)糖尿病腎病大鼠腎臟組織中RhoA 及ROCK1 表達(dá)；廖山嬰等[33]研究證實復(fù)方斑蝥膠囊可降低N- 甲基-N’- 硝基- 亞甲基胍誘導(dǎo)的大鼠腺胃癌發(fā)病率， 而其作用機(jī)理可能為抑制RhoA/ROCK 信號通路。

總之，筆者認(rèn)為在思考CNIED 的防治策略以及篩選RhoA/ROCK 信號抑制劑的過程中，我們應(yīng)該充分利用自己的特有資源，在對CNIED 中醫(yī)發(fā)病機(jī)理進(jìn)行思考的同時，結(jié)合現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)、計算機(jī)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)等對中醫(yī)中藥這個偉大的寶庫深入地挖掘。

四、小結(jié)

自Chitaley 等于2001 年首次報道ROCK 抑制劑（Y-27632）對大鼠海綿體平滑肌張力的調(diào)節(jié)作用以來，RhoA 信號在勃起功能中的調(diào)控受到了諸多學(xué)者的關(guān)注。 實際上，ROCK 抑制劑（法舒地爾）在臨床中已被用于治療心血管疾病，但因其處于相對上游的通路位點，作用靶點廣泛，故限制了其運用于ED 的治療。 一項關(guān)于ROCK 特異性相對較高的抑制劑（SAR407899）治療CNIED 的臨床試驗2 期已于2011 年結(jié)束，但其結(jié)果并沒有公布，具體原因不清。 但是就目前的研究來看，以RhoA/ROCK 信號作為切入點研發(fā)治療CNIED 的相關(guān)藥物是具有潛力的。

同時，筆者認(rèn)為在探索CNIED 的防治策略時不可僅把目光集中于陰莖海綿體。實際上，CNIED 的發(fā)病因素是確切的，非醫(yī)源性或醫(yī)源性因素下造成的CN 損傷是導(dǎo)致此類ED 發(fā)生發(fā)展的根源，因此，在關(guān)注“陰莖康復(fù)”問題的同時亦應(yīng)注重CN 損傷的修復(fù)問題，結(jié)合前文所述，ROCK 抑制劑在促進(jìn)外周神經(jīng)再生方面亦可有所作為。 此外，還有研究表明，ROCK 抑制劑能夠延緩免疫缺陷小鼠中人類前列腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[34]，筆者設(shè)想對于RP 后患者而言，ROCK 抑制劑的運用也許不僅可改善其勃起功能、促進(jìn)CN 修復(fù)，還能抑制前列腺腫瘤復(fù)發(fā)，若進(jìn)一步研究能予以證實，那么這種治療策略對于RP 后ED 患者可謂是“一石三鳥”。

筆者所在課題組對CNIED 的中醫(yī)藥防治策略也十分關(guān)注，基于CNIED 發(fā)病過程中CN 受損、陰莖缺氧、海綿體纖維化等特征性病理生理環(huán)節(jié)， 認(rèn)為CNIED 的基本病機(jī)是“氣虛血瘀”，因此，運用益氣活血類方藥對CNIED 進(jìn)行干預(yù)研究。 研究中，我們發(fā)現(xiàn)益氣活血方藥可明顯改善CNIED 大鼠的勃起功能，且具有抗海綿體缺氧及纖維化作用，同時，益氣活血方藥可以顯著地抑制CNIED 大鼠海綿體內(nèi)RhoA/ROCK2 信號，雖然其中的機(jī)制還待進(jìn)一步探索， 但是我們認(rèn)為益氣活血方藥起效的部分作用機(jī)理可能與下調(diào)RhoA 和ROCK2 蛋白水平有關(guān)。綜上，以RhoA 信號為切入點，結(jié)合中西醫(yī)優(yōu)勢共同探索CNIED 的治療策略應(yīng)該是具有前景的。