黃曲霉菌在玉米不同生育期中侵入時期的研究

王 偉，吳翠平，李 潘，謝文靜，孫小芳，祁小波，龔國淑

(四川農業(yè)大學農學院，成都 溫江 611130)

黃曲霉菌(Aspergillusflavus)在自然界中廣泛存在，對人畜可致病，同時還能侵入玉米、花生、堅果等作物，降低產品品質，造成嚴重的經濟損失[1]。黃曲霉菌還能產生黃曲霉毒素(Aflatoxins)，包括B族、G族和M族等，具有強致癌性，可引起人畜急性中毒和肝臟癌變。20世紀60年代，英國轟動一時的“火雞事件”將黃曲霉菌首次曝光，成為研究黃曲霉菌的開端[2-5]。在玉米上，黃曲霉菌主要危害果穗，引發(fā)玉米黃曲霉穗腐病。由于黃曲霉菌產孢量大，生長溫度、濕度條件寬泛，在玉米生產上常大面積發(fā)生黃曲霉穗腐病，嚴重影響玉米產量；此外，黃曲霉菌在玉米收獲后交互侵染，使貯藏期玉米品質嚴重下降[6]。近年來，四川地區(qū)玉米黃曲霉穗腐病日趨嚴重，通過探究黃曲霉菌在玉米生育時期中的侵入時期，抓住關鍵時期對玉米黃曲霉穗腐病進行預防，對提高玉米產量和品質有著重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

玉米品種：正紅505。

儀器及工具：超凈工作臺、滅菌鍋、接種鏟、一次性針頭注射器、顯微鏡、血球計數(shù)板等。

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯200g，葡萄糖15g，瓊脂粉15g，水1000mL。

試驗地點：四川省崇州市四川農業(yè)大學現(xiàn)代農業(yè)研發(fā)基地。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離 于2018年在四川農業(yè)大學現(xiàn)代農業(yè)研發(fā)基地進行樣品采集，帶回實驗室進行組織分離，得到的分離物在25℃下培養(yǎng)3d，將單菌落邊緣幼嫩菌絲轉移至新的PDA培養(yǎng)基上，于28℃上繼續(xù)培養(yǎng)3d，重復2次，將菌株保存于PDA斜面上，4℃保存。

1.2.2 田間設計 共設置7個玉米生育時期和1個空白對照處理。每個處理接種20株，玉米行距80cm，株距40cm，每個處理種植2行，每行20窩，重復3次。各玉米生育時期分別為拔節(jié)期、揚花期、吐絲期、灌漿期、乳熟期、臘熟期、完熟期。

1.2.3 黃曲霉菌在玉米生育期中侵入時期的探究 將黃曲霉菌從試管中活化于PDA上，30℃培養(yǎng)3d，將幼嫩菌絲轉接到新的PDA上，30℃培養(yǎng)5d。將培養(yǎng)好的菌用0.01%Triton X-100溶液洗滌分生孢子，用血球計數(shù)板在顯微鏡下計數(shù)為1×106spore/mL。將準備好的孢子懸浮液在低溫中進行運輸。用10mL的一次性針頭注射器將孢子懸浮液沿著玉米穗子分化處(拔節(jié)期)、玉米穗子(剩余6個時期)的位置進行注射，每個處理接種20株，套袋，對照組用同樣的方法注射等體積的無菌水。在玉米完熟后10d收獲，統(tǒng)計觀察。

2 結果與分析

2.1 玉米不同生育期接種黃曲霉菌動態(tài)觀察

通過對玉米拔節(jié)期、揚花期、吐絲期、灌漿期、乳熟期、臘熟期和完熟期7個生育時期接種黃曲霉菌發(fā)現(xiàn)，隨著玉米生育期的推移，最終累計在玉米果穗上的黃曲霉菌逐漸增加。從黃曲霉從揚花期開始有少量積累，但在吐絲期開始大量積累。但臘熟期和完熟期相對乳熟期和灌漿期較低，可能與接種天數(shù)有關。結果表明：黃曲霉菌在揚花期后開始逐漸侵入玉米果穗。

2.2 玉米不同生育期接種黃曲霉菌后病情指數(shù)統(tǒng)計

通過對玉米拔節(jié)期、揚花期、吐絲期、灌漿期、乳熟期、臘熟期和完熟期7個生育時期接種黃曲霉菌后統(tǒng)計發(fā)病率和病情指數(shù)發(fā)現(xiàn)，在拔節(jié)期時，玉米發(fā)病率為0，在揚花期發(fā)病率為25%，當在吐絲期，發(fā)病率為85.71%，相對揚花期顯著增加。直到灌漿期后，發(fā)病率為100%。另一方面，在揚花期病情指數(shù)為6.94，到吐絲期病情指數(shù)顯著增加，為38.10；灌漿期病情指數(shù)達到最大值，為47.47；隨后病情指數(shù)降低。從發(fā)病率可以看出，當灌漿期以后，發(fā)病率為100%，表明每個穗子接種成功。但灌漿期以后病情指數(shù)下降，則與接種時間與調查時間的差值相關。

3 討論

探究黃曲霉在玉米植株上侵入時間對預防玉米黃曲霉穗腐病有著重要的意義，前人研究證明黃曲霉菌侵入玉米時期為吐絲期[7]。但因地理位置多樣性，黃曲霉菌的變異可能性增加，不同地區(qū)黃曲霉菌的屬性可能不同，我們針對四川省崇州地區(qū)再次驗證黃曲霉菌侵入玉米的生育時期，對四川地區(qū)玉米黃曲霉穗腐病的預防有著重要意義。研究結果表明，黃曲霉菌在玉米揚花期開始有少量積累，吐絲期積累量增加，灌漿期積累量顯著增加，并達到最大值。在揚花期接種黃曲霉菌的玉米發(fā)病率為25%，當?shù)竭_吐絲期后，玉米發(fā)病率為85.71%，到灌漿期后發(fā)病率為100%。因此，黃曲霉菌主要從玉米花絲通道侵入。玉米從營養(yǎng)生長轉變?yōu)樯成L后，當花絲器官成熟時，黃曲霉菌開始在花絲器官上著生，當玉米果穗成熟后即臘熟后開始著生于玉米籽粒上。本試驗結果表明灌漿期后玉米黃曲霉開始大量積累，而臘熟或者完熟時黃曲霉的積累量降低。其原因在于灌漿期到生理成熟后期時間間隔約60d，而完熟期至調查時期僅10d，病原菌在果穗上的生長時間對在果穗上的積累量有著重要的影響。揚花期及吐絲期的病原菌積累量不多，這可能與接種黃曲霉后，隨著時間的推移，黃曲霉菌部分死去，導致病原菌量積累較少。