抑制COX-2表達對心肌缺血再灌注損傷過程中心肌細胞保護作用的研究

賈 丹，張 媛，連 鑫，龐 磊，麻海春，姜 曦

(吉林大學第一醫院 1.泌尿外二科；2.麻醉科；3.健康管理中心，吉林 長春130021)

研究表明在缺氧缺血的心肌細胞中，環氧化酶(COX-2)呈高水平表達，且其表達水平直接影響心肌細胞發生凋亡的嚴重程度[1-3]。雖然介導心肌細胞缺血再灌注損傷(MI/RI)的分子機制尚未完全明了，但MI/RI過程可能涉及眾多潛在的病理生理學機制，例如細胞凋亡的激活、活性氧(ROS)的形成，以及炎癥反應等。本研究通過對大鼠心肌細胞(H9C2)進行缺氧/復氧(H/R)實驗，研究MI/RI過程中，COX-2表達水平與細胞損傷之間潛在的因果聯系與分子基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗分組

將大鼠心肌細胞H9C2(ATCC公司，美國)隨機分為三組：對照組(CTL)、缺氧/復氧組(H/R)和給藥組[H/R+10 μM Helenalin(H/R+H)，或H/R+10 μM NS398(H/R+N)][4]，細胞培養及處理方法詳見文獻[5]。

1.2 細胞活力檢測

采用乳酸脫氫酶(LDH)活性檢測試劑盒(Roche公司，德國)檢測不同組別細胞培養基中LDH的活性，判定各組細胞損傷的程度[6]。

1.3 免疫印跡試驗

采用免疫印跡方法對各實驗組細胞中的蛋白表達水平進行檢測，檢測所需抗體及其稀釋倍數分別為：COX-2(1∶1000)、β-action(1∶1000)、IκBα(1∶1000)、p-IκBα(1∶1000)、p65(1∶1000)、p-p65(1∶1000)。實驗所需抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。采用Image J軟件對蛋白表達水平進行定量分析。

1.4 COX-2活性分析

采用COX活性檢測試劑盒(Cayman，美國)，通過熒光法對各實驗組細胞中的COX-2活性進行檢測。

1.5 ROS含量測定

分別將各組細胞接種在96孔板上，對其進行不同組別的預處理，然后用二氫乙錠孵育細胞，收集細胞并檢測熒光，評估細胞內ROS含量。

1.6 實時定量PCR(qPCR)分析

提取并收集各組細胞中的mRNA，取等量不同組別的mRNA進行qPCR，反應條件如下：95℃變性30 s，95℃擴增6 s，重復40個循環，60℃30 s。選取同一樣本中的β-actin作為內參，對各組數據進行比較分析。引物序列詳見文獻[7]。

1.7 數據統計學分析

本研究采用SPSS21.0軟件包進行統計學處理，使用GraphPad Prism 5.0軟件做圖，采用單因素方差分析進行多組間比較，組間兩兩比較采用t檢驗。P<0.05時，差異被認為具有統計學意義。

2 結果

2.1 NFκB的激活介導H/R過程中COX-2表達上調

H/R能夠誘導心肌細胞發生損傷，實驗組細胞在受到H/R刺激后，COX-2表達水平上升，LDH釋放量明顯高于對照組細胞；而加入NFκB抑制劑Helenalin處理后，COX-2水平下降，心肌細胞的LDH釋放量下降(圖1)。

圖1 H/R誘導后，各組細胞LDH釋放水平差異

在H9C2細胞受到H/R刺激后，伴隨COX-2升高的同時，IκBα降解增強，IκBα水平下降，IκBα和p65的磷酸化增強；Helenalin能夠有效抑制上述變化(圖2)。

2.2 抑制COX-2活性能夠降低H/R誘導的促炎癥因子轉錄

與對照組相比，H/R刺激選擇性地誘導白介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNFα)的mRNA表達，而不影響白介素-1β(IL-1β)；給予COX-2選擇性抑制劑NS398可顯著抑制IL-6和TNFα的高表達(圖3)。

2.3 抑制COX-2活性能夠降低H/R誘導的H9C2心肌細胞內ROS活性

在細胞受到H/R刺激后，與對照組相比，H/R組中ROS活性明顯升高；然而，這種H/R誘導的ROS活性增加能夠被COX2選擇性抑制劑NS398顯著抑制(圖4)。

3 討論

一直以來，COX-2被認為與炎癥反應息息相關，包括血管舒張、組織水腫和疼痛[8]，有研究顯示，COX-2的效應蛋白前列腺素在MI/RI炎癥反應中發揮重要作用[9]。前期研究顯示，抑制COX-2將通過Akt/iNOS/NO信號通路保護心肌細胞免受凋亡的影響[6]。

研究中發現，細胞在受到H/R刺激時，伴隨COX-2升高的同時，IκBα降解增加，IκBα和p65的磷酸化增強，以上結果均提示NFκB蛋白被激活[10]。為了檢測在H/R過程中心肌細胞中COX-2的誘導是否由NFκB介導，我們采用NFκB選擇性抑制劑Helenalin對細胞進行預處理。抑制劑預處理顯著抑制了H/R所導致的COX-2誘導，提示H/R過程中COX-2表達上調由激活的NFκB介導。

圖2 受到H/R刺激后，各組細胞中不同蛋白的表達水平變化及量化分析

圖3 H/R后，各組細胞中IL-1β、IL-6和TNFα的mRNA表達水平及量化分析

圖4 H/R后，各組細胞中ROS活性量化分析

缺氧能夠誘發心肌細胞發生無菌性炎癥，大量炎癥因子釋放，細胞趨化、浸潤對心肌細胞造成損傷，導致心肌細胞凋亡以及隨后的心功能障礙[11]。本研究發現，H/R刺激選擇性地誘導心肌細胞IL-6和TNFα的mRNA表達，二者是已知與促凋亡作用相關的炎癥因子[12,13]。TNFα是經典NFκB信號通路的重要激活因子[14]，當其轉錄活性增強時，能夠激活NFκB表達，并進一步介導COX-2表達，造成心肌細胞損傷。COX-2選擇性抑制劑NS398能夠顯著抑制H/R介導的IL-6和TNFα轉錄水平變化，提示抑制COX-2活性能夠降低H/R誘導的促炎癥因子轉錄，從而發揮對心肌細胞的保護作用。然而，對COX-2活性進行選擇性抑制后，IL-6和TNFα的mRNA水平下調的分子機制尚不清楚，值得進一步研究和探討。

MI/RI的發病機制十分復雜，涉及眾多病理生理因素的相互關聯，ROS聚集被認為是導致MI/RI的重要原因之一[15]。在生理狀態下，體內的ROS通過多種細胞外和細胞內的代謝活動產生，ROS水平處于動態平衡狀態[16]。而在心肌缺血狀態下，COX-2被活化，在其催化前列腺素合成的過程中有大量ROS產生[17]，并促進了心肌損傷進一步加劇[15]。此外，過量的ROS產生還能夠打破NOS與NO之間的動態平衡，并影響NO的生物利用度[18]。有研究顯示，在MI/RI過程中，減少心肌細胞中ROS的形成，能夠在心臟組織中產生更高的NO含量，并縮小梗死面積[19,20]。本研究中我們發現，在細胞受到H/R刺激后，ROS活性明顯上升，而這一現象能夠被COX-2選擇性抑制劑NS398顯著抑制。這些證據表明，抑制COX-2活性能夠降低H/R誘導的H9C2心肌細胞內ROS活性，減輕細胞損傷。

目前，COX-2選擇性抑制劑廣泛應用于缺血性心臟病的治療，進一步了解COX-2如何影響心肌細胞凋亡可能具有深遠的臨床意義。本研究的結果證實，在心肌細胞受到缺氧刺激時，NFκB的激活誘導COX-2表達上調，抑制COX-2活性能夠降低H/R誘導的促炎癥因子轉錄以及ROS活性增強，從而發揮對心肌細胞的保護作用。