缺血預處理星形膠質細胞GDNF抑制p38MAPK 信號通路減輕神經元凋亡

李昕華，徐曉燕，劉艷華

(長春市中心醫院，吉林 長春130051)

在神經元缺血損傷中星形膠質細胞通過多種途徑起著內源性保護作用[1]，缺血預處理能調動內源性保護機制，對后續的致死性缺血產生耐受[2,3]。膠質細胞源性神經營養因子(GDNF)對神經元的增殖、凋亡和軸突形成、突觸發生及突觸的可塑性等許多方面起調節作用，對受損的中樞神經系統神經元有著很強的保護作用[4,5]。本課題組前期研究發現缺血預處理后星形膠質細胞分泌GDNF增加，本實驗通過提取缺血預處理后的星形膠質細胞培養基制備條件培養基(ACM)，沉默GDNF基因后制備另一種條件培養基，利用不同的ACM孵育缺血預處理神經元，檢測神經元凋亡及p38MAPK、p-p38MAPK的蛋白表達，探討在缺血預處理中星形膠質細胞分泌GDNF的腦保護作用及作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

Wistar大鼠購自吉林大學動物實驗中心。高糖DMEM 干粉培養基、胎牛血清及馬血清購自美國GIBCO公司，EGFP表達質粒購自武漢晶賽生物技術公司，AnnexinV-FITC、PI購自南京凱基生物科技發展有限公司，兔抗單克隆p38 MAPK一抗、兔抗單克隆p-p38 MAPK一抗購自美國Cell Signaling公司，辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗購自美國Santa Cruz公司。

1.2 大鼠皮層神經元及星形膠質細胞氧糖剝奪模型制備

見本課題組前期研究[6,7]。

1.3 制備條件培養基并孵育神經元后測定神經元凋亡

取正常培養的星形膠質細胞培養基，離心15 min后取上清，即為ACM1；前期實驗研究發現[8]，OGD預處理及再缺血后星形膠質細胞分泌GDNF在再灌注24 h表達最高，取這一時間點的星形膠質細胞培養基，離心15 min后取上清，即為ACM2；利用EGFP表達質粒沉默GDNF基因，轉染的星形膠質細胞缺血再灌注24 h后GDNF沉默效果最佳，選取此時的培養基，離心15 min后取上清，即為ACM3。將神經元分為對照組、預處理組、預處理+缺血組、缺血組四組，分別用3種條件培養基孵育4組神經元，24小時后AnnexinV-FITC/PI雙標記流式細胞術(FCM)測定神經元凋亡率。將神經元用0.125%胰酶消化成單細胞懸液，取1 ml細胞懸液，離心棄上清后加入Binding Buffer 500 μl重懸，加入5 μl AnnexinV-FITC，混勻后加入5 μl PI ，反應15 min后用流式細胞儀檢測。Cellquest軟件分析結果，計算凋亡細胞的百分率。

1.4 神經元 p38MAPK、p-p38MAPK的檢測

Western Blot法檢測神經元p38MAPK、p-p38MAPK的表達，上述四組神經元用3種條件培養基孵育24小時后用Western blot法檢測。將神經元用PBS洗滌2次，裂解細胞后收集上清蛋白質，用考馬斯亮蘭G250試劑盒測定蛋白濃度。配制SDS-PAGE膠，將蛋白加入加樣槽后電泳，轉膜，封閉，將第一抗體按1∶800稀釋后加入放置NC膜的封閉袋中4℃靜置過夜。將第二抗體按1∶1000稀釋后放入封閉袋中，37℃孵育1 h。按照北京中杉金橋生物試劑公司的DAB顯色試劑盒說明書進行操作，用凝膠圖像分析系統掃描電泳結果，進行吸光度分析，計算p38MAPK、p-p38MAPK與GAPDH光密度的比值，得出蛋白質水平。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 各組神經元凋亡率檢測結果

正常對照組和預處理組均可見極少量的壞死細胞和凋亡細胞，加入3種不同的ACM后凋亡率變化不明顯(P>0.05)。預處理+缺血組和缺血組神經元凋亡率明顯高于正常對照組和預處理組(P<0.05)，加入ACM2后凋亡率較ACM1和ACM3兩組均明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。結果見表1、圖1。

表1 AnnexinV-FITC/PI FCM檢測神經元凋亡率(n=36，%)

圖1 ACM2預處理+缺血組FCM，可見神經元凋亡和壞死，早期神經元凋亡率較ACM3組低

2.2 各組神經元 p38MAPK蛋白表達

每組神經元的p38MAPK蛋白表達均無明顯變化(P>0.05)，結果見表2。

表2 神經元p38MAPK表達(n=36，%)

2.3 各組神經元p- p38MAPK的蛋白表達

預處理+缺血組及缺血組p- p38MAPK的蛋白表達均明顯高于照組和預處理組，在任何一種條件培養基培養下都是如此表達趨勢，差異有統計學意義(P<0.05)。預處理+缺血組p- p38MAPK的蛋白表達均較缺血組低，在任何一種條件培養基培養下都是如此表達趨勢，差異有統計學意義(P<0.05)。加入ACM2組的p- p38MAPK蛋白表達低于ACM1和ACM3兩組，ACM3組的表達較ACM1組稍高，但統計無顯著性差異(P>0.05)。結果見表3，圖2。

表3 神經元p-p38MAPK表達(n=36，%)

圖2 ACM2孵育后各組神經元p-p38MAPK表達

3 討論

缺血缺氧既可引起神經細胞壞死，也可造成神經細胞的大量凋亡[9]。本實驗利用AnnexinV-FITC/PI雙標記FCM檢測凋亡率，結果表明神經元氧糖剝奪后發生壞死及凋亡，缺血缺氧通過誘導神經元凋亡及壞死從而產生腦損傷，而神經元壞死不可逆，因此，抗神經元凋亡在防治缺血性腦損傷可能發揮重要作用。ACM2能顯著減少缺血神經元的凋亡，說明預處理使星形膠質細胞分泌GDNF通過減少神經元凋亡發揮腦保護作用。

絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)包括ERK通路、 p38MAPK通路、c-jun氨基末端激酶通路等。p38 MAPKs因通過細胞外應激和細胞內因子刺激而激活，故被稱為應激激活蛋白激酶，p38 MAPK信號通路與腦缺血再灌注損傷及神經系統退行性疾病有密切關系[10,11]。p38 MAPK經過典型的3級激酶級聯反應磷酸化激活p38(p-p38MAPK)，隨即作用于其下游因子或蛋白：tau蛋白、NFAT、ATF-2/6、PRAK等[11]，影響靶基因的轉錄或翻譯，調節中樞神經系統的多種病理、生理過程。組織或細胞發生缺血再灌注損傷時可見多種細胞因子參與，而細胞因子的產生與p38MAPK激活密切相關，再灌注產生的氧化物能激活p38MAPK，進而增加細胞因子的產生，造成組織或細胞缺血再灌注損傷，p38MAPK抑制對缺血再灌注損傷起到保護作用[12]。研究顯示，p38MAPK信號通路在神經元凋亡過程中起重要調控作用，激活p38MAPK信號通路可促進神經元凋亡，抑制p38MAPK信號通路可抑制神經元凋亡，減輕腦損傷[13]。本實驗發現在對照組、預處理組、預處理+缺血組及缺血組中神經元p38MAPK均無變化，在任何一種培養基中的表達也均恒定，但在預處理+缺血組及缺血組p- 38MAPK的蛋白表達均增多，說明在神經元缺血及缺血預處理后p38MAPK通過級聯反應活化為p-p38MAPK從而參與細胞凋亡。在任何一種條件培養基培養下預處理+缺血組p-p38MAPK均較缺血組低，提示缺血預處理通過激活p38MAPK信號通路減輕神經元凋亡發揮腦保護作用。加入ACM2組的p-p38MAPK蛋白表達低于ACM1和ACM3兩組，說明缺血預處理后星形膠質細胞分泌GDNF抑制p38MAPK信號通路的激活從而減少神經元凋亡，起到神經保護作用。