骨肉瘤患者的血漿長鏈非編碼RNA UCA1表達及臨床意義分析

井鴻雁，黃 斌，王 微

(吉林大學中日聯誼醫院,吉林 長春130033)

骨肉瘤是臨床上最常見的骨組織原發惡性腫瘤之一，約占全部骨腫瘤的20%，也是兒童和青少年的常見惡性腫瘤。骨肉瘤具有進展快、轉移早、預后差、易復發的臨床特點，通常以疼痛、腫塊、跛行等為主要表現，目前針對骨肉瘤的治療以手術和化療為主[1]，患者的預后與其臨床分期具有密切的關系，非轉移性骨肉瘤患者的術后5年存活率為50%-70%，而轉移性骨肉瘤患者的術后5年存活率僅為15%-30%[2]，因此，提高對早期骨肉瘤的診斷效率是改善患者預后的重要手段。隨著分子生物學研究的不斷深入，針對骨肉瘤的基因層面研究已逐漸從蛋白質編碼基因拓展至非蛋白質編碼基因，長鏈非編碼RNA(lncRNA)主要功能是對染色體發揮修飾作用，并在轉錄及轉錄后等多個層面發揮調控作用[3]，能夠直接參與腫瘤的增殖、侵襲、轉移等病理過程[4]。學者們已發現多種lncRNA通過復雜的機制參與了骨肉瘤的發生和發展，并介導其侵襲轉移過程[5]。近年來，一些研究者開始嘗試應用外周血lncRNA表達水平作為診斷骨組織惡性腫瘤的生物學標志物，取得了一定的進展[6]。尿路上皮癌胚抗原1(UCA1)是一種在胚胎組織中普遍表達的lncRNA，而在成人僅有心臟和脾臟組織有少量表達，在多種腫瘤組織中均可觀察到lncRNA UCA1的過表達，且其表達水平與腫瘤的侵襲轉移行為有關，本文針對骨肉瘤患者的血漿lncRNA UCA1表達及臨床意義進行了分析，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究資料

連續選取2017年6月-2019年6月在吉林大學中日聯誼醫院住院治療、符合本研究入選標準的194例骨腫瘤患者作為病例組，其中，118例骨肉瘤患者為惡性組，76例良性骨腫瘤患者為良性組，選取同期100例接受體檢者作為對照組，對三組研究對象的血漿lncRNA UCA1相對表達量進行檢測和分析，所有研究對象均對本研究知情并簽署知情同意書。

1.1.1納入標準 病例組患者均符合美國國家綜合癌癥網絡(NCCN)制訂的《骨腫瘤臨床指南(2017年版)》中的骨肉瘤和良性骨腫瘤診斷標準[7]，均經術前穿刺活檢或術后病理檢查確診。所有患者均為初診初治病例，臨床資料完整。對照組研究對象均經臨床檢查排除骨腫瘤。

1.1.2排除標準 合并有其它部位原發惡性腫瘤、骨及重要器官畸形、心肺肝腎等重要器官功能不全、血液系統疾病、心腦血管卒中者；入院前已接受抗腫瘤治療的患者；妊娠期或哺乳期患者。

1.2 觀察指標

1.2.1一般資料調查 對所有研究對象的年齡和性別進行統計調查；對惡性組患者臨床分期、腫瘤位置、遠處轉移情況進行統計調查；對良性組患者的腫瘤種類、腫瘤位置進行統計調查。

1.2.2血漿lncRNA UCA1相對表達量檢測 病例組于入院次日采集空腹外周靜脈血樣本4 ml，對照組研究對象于體檢當日采集空腹外周靜脈血樣本4 ml，經乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝處理后，血樣經3 000 r/min離心15 min后以微量取樣器吸取血漿，移入1.5 ml EP管置于-20℃冰箱中保存待測。檢測時將血漿樣品置于冰上融化，吸取250 μl血漿樣品，以Trizol試劑盒(美國Invitrogen公司)提取總RNA，以20 μl反應體系進行反轉錄獲得cDNA。以U6為內參、采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(q-PCR)檢測lncRNA UCA1相對表達量，引物序列及反應體系見表1、表2。反應程序為：起始模板變性95℃ 1 min，PCR模板變性95℃ 20 s，退火、延伸61℃ 31 s，連續反應45次。計算內參標準品與待測樣品的循環閾值(Ct值)，以2-ΔΔCt計算lncRNA UCA1相對表達量，每個樣品重復檢測3次取平均值作為最終測量值。

表1 q-PCR反應引物序列

表2 q-PCR反應體系

1.3 統計方法

2 結果

2.1 三組研究對象的一般資料情況

三組研究對象在年齡、性別構成方面的差異無統計學意義(P>0.05)，惡性組與良性組患者在腫瘤位置、腫瘤大小方面的差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 三組研究對象的一般資料情況對比

2.2 三組研究對象血漿lncRNA UCA1相對表達量的比較

三組研究對象血漿lncRNA UCA1相對表達量的差異有統計學意義(P<0.05)，其中，惡性組患者的血漿lncRNA UCA1相對表達量高于良性組或對照組，良性組患者的血漿lncRNA UCA1相對表達量高于對照組，各組之間的差異均有統計學意義(P<0.05)。見表4。

2.3 不同臨床特征骨肉瘤患者血漿lncRNA UCA1相對表達量的對比

在惡性組中，臨床分期為Ⅲ-Ⅳ期的患者的血漿lncRNA UCA1相對表達量高于臨床分期為Ⅰ-Ⅱ期的患者，出現遠處轉移的患者的血漿lncRNA UCA1相對表達量高于未出現遠處轉移的患者，差異均有統計學意義(P<0.05)，而不同年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤大小患者的血漿lncRNA UCA1相對表達量的差異無統計學意義(P>0.05)。見表5。

表4 三組研究對象血漿lncRNA UCA1相對表達量的比較

表5 不同臨床特征骨肉瘤患者血漿lncRNA UCA1相對表達量的對比

2.4 血漿lncRNA UCA1相對表達量診斷骨肉瘤的價值分析

血漿lncRNA UCA1相對表達量在骨肉瘤診斷、骨肉瘤與良性骨腫瘤鑒別診斷、Ⅲ-Ⅳ期骨肉瘤診斷及骨肉瘤伴遠處轉移診斷中的AUC分別為0.854、0.876、0.711、0.719，均具有統計學意義(P<0.05)，在Cutoff值下，血漿lncRNA UCA1相對表達量在骨肉瘤診斷、骨肉瘤與良性骨腫瘤鑒別診斷中的靈敏度分別為0.727、0.661，特異度均達到了1.000，在Ⅲ-Ⅳ期骨肉瘤診斷、骨肉瘤伴遠處轉移診斷中的靈敏度分別為0.852、0.870，特異度分別為0.626、0.568。見表6、圖1。

表6 血漿lncRNA UCA1相對表達量診斷骨腫瘤及骨肉瘤的ROC曲線分析

注：(A)診斷骨肉瘤的ROC曲線分析;(B)鑒別診斷骨肉瘤與良性骨腫瘤的ROC曲線;(C)診斷Ⅲ-Ⅳ期骨肉瘤的ROC曲線;(D)診斷骨肉瘤伴遠處轉移的ROC曲線

3 討論

本研究結果顯示，與健康人群相比，骨腫瘤患者的血漿lncRNA UCA1相對表達量較高，特別是骨肉瘤患者的血漿lncRNA UCA1相對表達量出現了顯著上調，血漿lncRNA UCA1相對表達量能夠作為骨腫瘤診斷和良性骨腫瘤與骨肉瘤鑒別診斷的輔助指標。近年來，僅有一項研究[8]針對骨肉瘤血循環中的lncRNA UCA1表達量進行了分析，該研究結果顯示，骨肉瘤患者的外周血lncRNA UCA1表達上調，在診斷骨肉瘤中的AUC為0.831，這與本研究結果基本一致，且該研究結果還顯示，高表達水平的lncRNA UCA1與較低的總生存率和無病生存率相關，是預測患者預后不良的獨立指標，但是，該研究選取的檢測材料為血清樣本，而且對照組僅為健康人群，與本研究設計方案存在一定的差異。筆者認為，骨肉瘤患者血漿lncRNA UCA1表達上調可能與腫瘤細胞中lncRNA UCA1過表達有關，在腫瘤細胞凋亡過程中，其細胞漿物質通過局部血液循環進入體循環。相關研究[9]已證實，lncRNA UCA1在骨肉瘤組織和細胞系中存在明顯的表達上調，且其高表達與腫瘤大小、腫瘤分級、遠處轉移、臨床分期等臨床特征密切相關，在敲除抑制lncRNA UCA1基因后，骨肉瘤細胞的增殖、侵襲和遷移受到抑制，細胞凋亡加快。通過細胞定位和組織表達譜分析，UCA1基因主要定位于癌細胞的細胞漿，其表達水平要明顯高于癌旁組織，雖然腫瘤患者體液中的lncRNA UCA1表達水平一般遠遠低于腫瘤組織，但仍然可觀察到患者體液樣本中lncRNA UCA1表達水平的異常上升，比較典型的例子是，相關研究[10]已證實，膀胱癌患者尿液中的lncRNA UCA1表達水平可用于膀胱癌的診斷，不僅具有較高的敏感性和特異性，而且結果穩定性也較好；此外，針對肝細胞癌、食管鱗癌患者血清lncRNA UCA1表達的研究[11,12]也得出相似的結論。因此，針對具有骨腫瘤癥狀的患者，在應用影像學手段的同時，針對其外周血lncRNA UCA1表達量進行檢測，能夠為疾病的鑒別診斷提供一種無創性的參考指標，從而為考慮是否采用進一步的有創診斷手段提供依據。

本研究結果顯示，臨床分期為Ⅲ-Ⅳ期及出現遠處轉移的骨肉瘤患者的血漿lncRNA UCA1相對表達量上調更加顯著，其水平可輔助診斷骨肉瘤臨床分期、遠處轉移等，這提示了lncRNA UCA1的過表達可能與骨肉瘤侵襲、轉移等生物學行為有關，血漿lncRNA UCA1相對表達量能夠作為預測骨肉瘤疾病進展程度的輔助指標。近年來，研究者針對lncRNA UCA1的促癌機制進行了大量研究[13,14]，發現了lncRNA UCA1在促進腫瘤細胞生長增殖、侵襲轉移、化療耐藥等多種惡性表型方面均發揮著關鍵性的作用，作為一種競爭性內源RNA，lncRNA UCA1主要通過作用于染色質修飾體、對染色體成環進行調節、轉化為微小RNA(miRNA)、吸附miRNA等機制，在表觀遺傳學水平上對靶基因發揮間接調節作用，從而參與了腫瘤病理過程的調控。通過對非小細胞肺癌、黑色素瘤、咽鱗狀細胞癌等的基礎醫學研究[15-17]，研究者已發現了lncRNA UCA1可對miRNA-185-5p、miRNA-582-5p、miRNA-143、p21等下游基因和β-Catenin等分子通路發揮調控作用從而發揮促癌作用，主要表現為抑制腫瘤細胞的凋亡并上調基質金屬蛋白酶、Ki67等侵襲相關蛋白的表達。此外，進一步的研究[18]還證實，外源性加入lncRNA UCA1可促進癌細胞葡萄糖消耗量和乳酸生成量的提升，增強癌細胞的生存及運動能力，從而促進腫瘤的侵襲和轉移。而在針對骨肉瘤的研究[19-21]中，研究者也發現，骨肉瘤組織可通過表達C-C基序趨化因子配體18、低氧誘導因子-1α等誘導lncRNA UCA1的表達，而lncRNA UCA1能夠通過調控miRNA-582及影響PI3K/AKT/mTOR、PTEN/AKT、Wnt/β-catenin等信號通路，促進上皮細胞-間充質轉化(EMT)過程，從而促進骨肉瘤細胞的轉移，最終促進了腫瘤的進展和遠處轉移。由于骨肉瘤具有早期轉移快、化療易耐藥的特點，故中晚期或出現遠處轉移患者的預后通常較差，因此，臨床醫生應充分發揮lncRNA UCA1等遺傳學指標的作用，努力提高對早期骨肉瘤的診斷效率，對遠處轉移等進行充分的預測，從而達到改善患者預后的目的。

值得提出的是，限于研究時間和經費，本文未對患者的術后生存期進行隨訪，也未將lncRNA UCA1與其它生物學標志物進行橫向對比，這是本研究的不足之處，將在后續的研究中予以補充。

綜上所述，骨腫瘤患者可出現血漿lncRNA UCA1相對表達量的上調，特別是骨肉瘤患者的血漿lncRNA UCA1過表達更加明顯，血漿lncRNA UCA1相對表達量與骨肉瘤的疾病進展和遠處轉移有關，可作為骨肉瘤診斷及病情評價的輔助指標。