腎透明細胞癌組織中Cripto-1的表達及其對預后的預測價值

羅文山，趙凌昆，劉婷婷， 張秀利*

(1.吉林大學中日聯誼醫院，吉林 長春130033；2.佳木斯大學臨床醫學院，黑龍江 佳木斯154007；3.吉林省軍隊離退休干部療養中心，吉林 長春130033)

腎透明細胞癌(ccRCC)是腎細胞癌中最常見的一種病理類型，約占所有腎細胞癌的80%-90%[1]。目前臨床上常用TNM分期和Fuhrman核分級對ccRCC的預后進行預測[2]，但相似的TNM分期或Fuhrman核分級的病人也可能有著不同的預后[3]，這顯然不符合精準醫學的要求。目前也尚無一種理想的預測ccRCC的標志物。Cripto-1也稱作畸胎瘤衍生生長因子-1(TDGF-1)[4]，是糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定信號家族的一員[5,6]。目前研究結果表明，Cripto-1在胃癌[7]、乳腺癌[8]、食管鱗癌[9]等惡性腫瘤中高表達，且其表達量與腫瘤惡性程度成正比，與患者生存成反比。Klauzinska等人[10]的研究結果提示Cripto-1可能參與了上皮-間質轉化(EMT)。本研究旨在觀察Cripto-1在ccRCC中的表達情況，并統計分析其對預后的價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料收集佳木斯大學附屬第二醫院病理科2014年1月至2016年12月期間，腎透明細胞癌根治術標本和對應的癌旁正常組織標本共76對。年齡38—82歲，平均年齡(59.3±9.5)歲。納入標準：(1)非囊性的散發病灶；(2)術后病理證實為ccRCC；(3)臨床資料完整，完成定期隨訪。排除標準：(1)雙側病灶；(2)合并其它惡性腫瘤；(3)曾接受過化療、靶向治療、免疫治療、中醫治療等抗腫瘤治療；(4)圍術期發生死亡。病理分期采用TNM分期(2010年AJCC發布)，并根據Fuhrman核分級進行分級。本次研究通過佳木斯大學倫理委員會批準。

1.2 細胞系及試劑人ccRCC細胞系786-O與Caki-1，人腎上皮細胞系293T均購自國家實驗細胞資源共享平臺。其中786-O和Caki-1用10%胎牛血清(FBS)、0.2%雙抗青霉素和鏈霉素的RPMI-1640培養基，293T用10%胎牛血清、0.2%雙抗青霉素和鏈霉素的DMEM培養基。細胞培養條件為恒溫37℃，恒定濕度，5%濃度的CO2。培養基均購自Gibico公司；Trizol購自Thermol公司；反轉錄試劑盒、RT-qPCR試劑盒購自谷歌生物技術有限公司；兔抗人Cripto-1單克隆抗體、β-actin單克隆抗體、羊抗兔辣根過氧化物酶標記的二抗，免疫組化試劑盒均購自CST公司。

1.3 實驗方法免疫組化染色嚴格按照試劑盒說明書進行，根據染色強度和結合程度綜合評分判定結果：無染色(0分)，淡黃色(1分)，棕黃色(2分)，黃褐色(3分)；陽性細胞<5%(0分)，5%-25%(1分)，26%-50%(2分)，>50%(3分)。將染色程度和陽性染色細胞數量得分相乘，≥6分為陽性表達，<6分為陰性表達。應用RT-qPCR檢測mRNA表達情況。應用Western-blot檢測蛋白表達情況。應用shRNA對Cripto-1基因表達進行敲降。應用CCK-8檢測細胞增殖能力。應用Transwell實驗檢測細胞遷移能力。

1.4 復查與隨訪方法術后24個月內，每3個月復查1次；第3年起，每6個月復查一次。復查內容包括血清腫瘤標志物檢查、胸腹盆腔CT等。所有患者均實行門診或電話隨訪，結合相關護理情況。終止時間定義為經病理學診斷為復發、因腫瘤死亡，或隨訪滿60個月。

1.5 統計學方法所有數據應用SPSS(Ver 19.0 IBM，NY)進行統計分析。本次研究所有數據結果均經過三次生物學重復，數據以(均數±標準差)的形式表示。分類變量應用卡方檢驗，計量資料用Studentt檢驗，生存曲線應用Kaplan-Meier方法繪制，并應用對數秩檢驗評估差異。應用Cox比例風險模型進行單因素和多因素分析。

2 結果

2.1 Cripto-1在腫瘤組織和正常腎組織中的表達情況對腫瘤組織和正常腎組織Cripto-1進行免疫組化染色，可以發現，Cripto-1主要定位在細胞質中。Cripto-1在腫瘤組織中，無論是蛋白水平，還是mRNA水平的表達顯著高于正常組織(P<0.05)。見圖1。

a.在正常腎組織中陰性表達；b.在腫瘤組織中弱表達；c.在腫瘤組織中強表達；d.兩種組織中Cripto-1 mRNA相對表達量；e.Cripto-1蛋白在兩種組織中的表達情況

2.2 Cripto-1的表達與臨床病理參數的關系根據Cripto-1的表達對患者進行分組，76例病人中，Cripto-1高表達49例，低表達27例。Cripto-1的表達與T分期、N分期、TNM分期相關(P<0.05)，而與性別、年齡和Fuhrman核分級無相關性(P>0.05)。見表1。

2.3 Cripto-1的表達與患者預后的關系Cripto-1高表達組的患者5年無病生存率(DFS)和總體生存率(OS)均顯著低于低表達組(P<0.05)。見圖2。

2.4 Cripto-1的表達對細胞增殖、遷移和侵襲的影響為了觀察Cripto-1對細胞增殖、遷移和侵襲的影響，利用shRNA對786-O與Caki-1兩株細胞系的Cripto-1進行敲降，構建Cripto-1低表達的穩轉細胞株。并檢測細胞增殖、遷移和侵襲的變化。結果發現，在敲降Cripto-1之后，細胞的增殖活性、遷移能力和侵襲能力均發生不同程度的降低。見圖3。

表1 Cripto-1表達與臨床病理參數的關系

a.兩組總生存率比較；b.兩組無病生存率比較

3 討論

Cripto-1屬于表皮生長因子-富半胱氨酸(EGF-CFC)家族，目前發表的研究結果大部分認為，其作為發揮調解細胞分化和胚胎發育功能的蛋白，主要在胚胎早期表達，同時，當體內細胞發生上皮間質轉化，或形成腫瘤時，Cripto-1也出現高表達，并且在多項研究中已經證實，其可能會促進腫瘤細胞的增殖，提高腫瘤細胞遷移和侵襲的能力[11-13]。另外，也有研究者認為其可能與腫瘤預后有關[14,15]。Cripto-1是否在腎透明細胞癌中也發揮著同樣的作用，目前相關研究較少。

本研究對76對ccRCC腫瘤組織和正常組織進行了免疫組化染色，并提取組織中RNA和蛋白，行RT-qPCR和Western blot檢測，發現在ccRCC組織中，無論是mRNA還是蛋白水平，Cripto-1的表達均顯著升高。這提示Cripto-1在ccRCC的惡性進展中，可能也起到了一定的作用[16,17]。而Cripto-1并不是完全在正常組織中不表達，在IHC結果中也發現有部分正常腎組織也表現為Cripto-1弱陽性表達，回顧這些病例，發現大多為分期較晚的患者，這種現象可以用“區域性癌化”來揭示，即腫瘤的發生是一個累積的過程，遺傳物質在逐步發生改變，正常組織在轉變為惡性癌組織之前，已經開始呈現了一種“癌前”的狀態，這種形態下的細胞，形態學上是正常的，但是遺傳物質可能已經發生了改變。這也提示Cripto-1是否可以作為一個標志物，去鑒別形態學正常的細胞，是否即將發生惡性改變，這個問題值得進一步研究。

(A-D)786-O與Caki-1細胞系在敲降Cripto-1后增殖能力的變化；(E-F)Transwell實驗驗證786-O與Caki-1細胞系在敲降Cripto-1后遷移能力的變化；(G-H)劃痕實驗驗證786-O與Caki-1細胞系在敲降Cripto-1后侵襲能力的變化

根據IHC的結果，將患者分為Cripto-1高表達組和低表達組，并對臨床病理資料進行了統計分析，結果發現Cripto-1高表達組的患者，腫瘤惡性程度更高，Cripto-1高表達組有23例(46.94%)患者為T3-T4期，28例患者(57.14%)存在淋巴結轉移，22例患者(44.90%)的TNM分期為Ⅲ-Ⅳ期，這些都顯著高于Cripto-1低表達組(P<0.05)。而進一步對患者進行隨訪時發現，Cripto-1高表達組的患者，無論是5年無病生存率還是總生存率，均較Cripto-1低表達組的患者要差(P<0.05)。本研究又用體外實驗進行了原因的探索，選擇了本身Cripto-1表達較高的786-O和Caki-1細胞系，并應用shRNA對Cripto-1進行了敲降(Knockdown)，并進行了一系列的功能學實驗。結果發現，在敲降了Cripto-1之后，兩種細胞系的增殖、遷移和侵襲能力都受到了顯著的影響，具體表現為增殖速度下降、遷移和侵襲的能力下降。這提示Cripto-1的高表達，會提高腫瘤細胞的惡性潛能，使其增殖速度更快、遷移和侵襲能力更強，相應的，腫瘤發展更快，且更容易發生術后的復發和轉移，這也就解釋了Cripto-1高表達的患者預后更差的原因。這也同時提示Cripto-1可能作為一個靶點，對ccRCC進行靶向的治療。

本研究的局限之處在于，這是一項單中心的回顧性研究，且樣本量較小，可以增加中心，擴大樣本量進一步對本研究的結果進行驗證。另外，本研究僅進行了體外實驗的研究，并未進行體內實驗，而腫瘤所處的微環境對于腫瘤的發展也至關重要。目前有研究認為Cripto-1可以激活Wnt/β-Catenin信號通路[18]，從而使腫瘤細胞發生上皮間質轉化，但本研究并未對該通路的標志蛋白進行檢測，未來會進行相關機制方面的探索。

綜上，Cripto-1在腎透明細胞癌中表達升高，可以作為判斷預后的一項指標，同時也可能成為治療ccRCC的新靶點。