血清MicroRNA 122和MicroRNA-130a水平在隱匿性乙型肝炎病毒感染中的診斷價值初探

徐蘭鋒， 王 倩， 劉洪玲， 遲男男

(1.遼寧省錦州市中心醫院, 遼 寧 錦 州 121001 2.佳木斯大學附屬第一醫院消化二科， 黑龍江 佳木斯 154003)

乙型肝炎病毒(HBV)是一種傳染性疾病，感染人群中約25%的人可發展為慢性乙型肝炎患者，并可能進一步發展成為肝硬化、肝癌等疾病，嚴重危害人們生命健康[1]。隱匿性乙型肝炎(OBI)是HBV感染的一種特殊狀態，一般是指血清學檢測HBsAg陰性，但血清或肝臟組織中HBV呈陽性，其滴度一般在200 IU/mL以下[2]。作為HBV感染傳播的潛在威脅，是乙肝預控的一大障礙，有著重要公共衛生意義。研究表明[3]，OBI與慢性肝病發生、進展緊密關聯，是爆發性肝炎的重要危險因素。近年來，微小核糖核酸(microRNA)在乙肝產生、演變進程中的作用日益引起關注。研究證據表明，microRNA能夠對HBV復制及人體免疫力產生影響，從而參與乙肝病程發展機制。如有研究發現[4]，miR-122在肝癌細胞中過度表達能夠抑制肝癌進展。還有研究指出[5]，miR-130a可以調控介導HBV相關雌激素α受體表達從而對HBV的復制產生抑制作用。本研究旨在研究血清miR-122、miR-130a和OBI關聯性，及其作為新的循環標志物診斷OBI的臨床價值，現報告如下。

1 資料與方法

1.1臨床資料:選取2018年6月至2019年6月我院收治的慢性乙型肝炎(CHB)患者60例(CHB組)、非活動性HBsAg攜帶患者(ASC)60例(ASC組)及OBI患者60例(OBI組)；CHB組：男35例，女25例，年齡(53.78±10.22)歲；ASC組：男38例，女22例，年齡(53.78±10.68)歲；OBI組：男40例，女20例，年齡(51.87±9.65)歲。納入標準：①CHB、ASC、OBI都滿足《慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)》[8]的診斷標準；②愿意接受相關檢查。排除標準：①同時伴其他類型肝炎病毒或其他肝損害者；②人類免疫缺陷病毒感染者；③伴嚴重心腦腎疾病者；④存在酗酒史者；⑤有結核病史或血吸蟲病史者。另收集可疑患者60例(對照組)，均排除肝病、傳染病史及免疫疾病等，其中男36例，女24例，年齡(52.45±9.78)歲。各組性別、年齡等比較無統計學差異(P>0.05)。

1.2方 法

1.2.1標本采集：所有對象均采集清晨肘靜脈血6mL，離心(6070r/min)8min，取上清液，裝于離心管中，再次離心(1.3×104r/min)8min，取上清液，置-80℃環境下儲存備用。

1.2.2總RNA的提取：取血清200μL，以miRcute血清/血漿miRNA提取試劑盒進行總RNA提取，嚴格按試劑盒說明書進行操作。無菌條件下，采用NanoDrop200超微量分光光度計進行RNA濃度及純度測定。當A260/A280值在1.80～2.00范圍內，即可認為所提取的RNA純度合格。

1.2.3血清miR-122、miR-130a檢測方法：采用熒光定量PCR法，以兩步法檢測miR-122、miR-130a，按美國Applied Biosystems公司TaqMan-microRNA逆轉錄試劑盒說明進行反轉錄反應。熒光定量PCR，應用通用的反轉錄條件轉錄目的miRNAs，95℃ 30s、95℃ 10s、55℃ 15 s、72℃ 20 s，40次循環，以cel-miR-39作為內參，參照公式計算miR-122、miR-130a的相對表達量。

2 結 果

2.1比較四組患者的miR-122、miR-130a含量：各組血清miR-122、miR-130a相對含量比較有統計學差異(P <0.05)。OBI組miR-122相對含量明顯低于對照組、ASC組、CHB組(均P<0.05)，miR-130a相對含量明顯高于對照組、ASC組、CHB組(均P<0.05)；且miR-122相對含量在OBI組、對照組、ASC組、CHB組間依次增高(均P<0.05)，miR-130a相對含量在OBI組、CHB組、ASC組、對照組間依次降低(均P<0.05)。見表1。Pearson相關性研究顯示，OBI組miR-122與miR-130a呈負相關(r=0.421，P<0.05)。

表1 四組患者miR-122 miR-130a含量比較

2.2各組miR-130a/miR-122值比較：為進一步探討OBI患者miR-122、miR-130a表達情況，對兩者比值進行統計分析，結果顯示，miR-130a/miR-122值在OBI組為(2.13±0.64)，對照組為(0.76±0.25)，ASC組為(0.72±0.23)，CHB組為(0.70±0.22)，各組間比較有統計學差異(F=29.582，P<0.05)。兩兩比較顯示，OBI組miR-130a/miR-122值明顯高于ASC組、對照組及CHB組(均P<0.05)，而ASC組、對照組、CHB組之間兩兩比較均無統計學差異(均P>0.05)。

2.3血清miR-122、miR-130a及其比值在OBI中診斷分析：ROC曲線表示，血清miR-122、miR-130a及miR-130a/miR-122值區分OBI與可疑患者曲線下面積為0.859(95%CI：0.762～0.955)、0.844(95%CI：0.739～0.950)、0.945(95%CI：0.018～0.989)，最優截斷值分別為1.68、2.74、0.89，敏感度和特異度分別為80.2%和78.6%、87.6%和73.5%、92.1%和95.3%。 miR-130a/miR-122曲線下面積最大，因此miR-130a/miR-122在區分OBI與可疑患者的診斷價值更高。血清miR-122、miR-130a及miR-130a/miR-122值區分OBI與ASC曲線下面積分別為0.942(95%CI：0.021～0.995)、0.813(95%CI：0.699～0.927)、0.964(95%CI：0.012～0.997)，最優截斷值分別為1.74、2.68、0.84，敏感度和特異度分別為89.2%和86.7%、75.4%和80.3%、90.2%和93.6%。miR-130a/miR-122曲線下面積最大，因此miR-130a/miR-122在區分OBI與ASC的診斷價值更高。血清miR-122、miR-130a及miR-130a/miR-122值區分OBI與CHB曲線下面積分別為0.998(95%CI：0.000～1.000)、0.646(95%CI：0.503～0.789)、0.993(95%CI：0.000～1.000)，最優截斷值分別，敏感度和特異度分別為95.2%和100.0%、72.3%和59.8%、96.4%和97.1%。miR-130a/miR-122曲線下面積最大，因此miR-130a/miR-122在區分OBI與CHB的診斷價值更高。

圖1 血清miR-122、miR-130a及miR-130a/miR-122值區分OBI與可疑患者ROC曲線

圖2 血清miR-122、miR-130a及miR-130a/miR-122值區分OBI與ASC的ROC曲線

圖3 血清miR-122、miR-130a及miR-130a/miR-122值區分OBI與CHB的ROC曲線

3 討 論

microRNA是一類真核生物內源性非編碼單鏈的小RNA分子，長約19～23個核苷酸，研究表明[6]，盡管microRNA在人體基因數中僅占2%，卻對30%以上人體基因的表達有著調控作用，參與了細胞增殖、凋亡等多種生物學行為，與多種疾病發生、進展緊密關聯。近年來，microRNA成為慢性肝病診斷及治療的研究熱點。microRNA能夠影響HBV復制，調控機體免疫功能，而對乙肝發生發展產生抑制或促進作用。有研究顯示[7]，乙肝患者的血清miR-375、miR-133含量明顯高于正常對照組，可作為乙肝肝癌早期診斷的新型循環標志物。雖然目前已有較多microRNA與HBV感染慢性肝病關系方面的文獻報道，然而關于OBI患者血清microRNA表達相關報道仍尚少。

miR-122是一種小分子RNA，可以作為人類肝臟特異性表達指標，可調節一系列生物信號網絡介導著肝臟細胞的增殖、分化、凋亡及肝臟病變的發生發展過程。有研究發現[8]，采取抗miR-122可抑制其表達，能夠引起HBsAg及HBeAg的分泌明顯降低。此外，Wang G等[9]研究表明，通過阻止miR-122表達能夠誘導HBV感染，引起干擾素失效，進而促進感染肝細胞中HBV復制。本研究顯示，OBI組血清miR-122相對表達量明顯低于ASC組及CHB組，且血清miR-122相對表達量在OBI組、對照組、ASC組、CHB組間依次增高，同時ROC曲線表示，miR-122可以很好地判斷OBI與可疑患者、ASC及CHB患者。認為與HBV感染有關，且和I型干擾素密切關聯的抗病毒反應，該機制在OBI的發展中有著重要作用。然而關于miR-122和HBV感染之間具體機制仍需深入探討。本研究還發現，OBI組miR-130a相對含量明顯高于ASC組、對照組及CHB組，且miR-130a相對含量在OBI組、CHB組、ASC組、對照組間依次降低。研究[7]認為，在HBV感染的肝細胞中，miR-130a能夠抑制HBV轉錄及蛋白質合成，從而降低HBV 的復制。研究表明[10]，miR-130a可能通過調控I型干擾素及mxA、ISG15等干擾素刺激基因的表達，從而對丙肝病毒DNA復制起到抑制作用。本研究也發現，OBI患者血清miR-122與miR-130a表達呈負相關，且OBI組miR-130a/miR-122值明顯高于對照組、ASC組及CHB組，考慮OBI患者miR-122與miR-130a相關關系及miR-130a/miR-122值增高可能與上述機制相關，但仍需進一步驗證。

血清生物標志物的檢測有著簡便、可重復性好等諸多優點，對疾病診斷有著很高實用性。本研究顯示，miR-122、miR-130a及miR-130a/miR-122值在OBI的診斷過程中起到重要作用，能夠很好地進行OBI與可疑患者、ASC及CHB區分。Chen y等[11]也曾探討了miR-122、miR-150OBI的臨床檢測價值，但其僅作了OBI患者與可疑患者及CHB患者的區分。

綜上，本研究發現，miR-122水平降低、miR-130a水平增高和OBI有一定關聯，且其作為新的循環標志物，對OBI診斷有重要價值，能夠很好地將OBI與可疑患者、ASC及CHB區分開來，值得臨床關注。