仙靈骨葆膠囊對(duì)去勢(shì)大鼠骨組織H3K36me3、H3K9me3及JMJD2A表達(dá)的影響

王粵淇 霍少川 陳德龍 張濛 唐宏宇 王海彬*

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)嶺南醫(yī)學(xué)研究中心中醫(yī)骨傷科學(xué)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510405 3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)骨科，廣東 廣州 510405

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種以骨吸收增多、骨顯微結(jié)構(gòu)損壞，最終導(dǎo)致易于骨折為特征的骨科疾病[1]。我國(guó)約有13%的人口患有骨質(zhì)疏松癥，且發(fā)病人數(shù)呈上升趨勢(shì)，推測(cè)2020年患者人數(shù)可達(dá)2.86億[2]。表觀遺傳是不通過(guò)DNA改變就能導(dǎo)致可遺傳的基因表達(dá)變化，這種變化的調(diào)控方式包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑和微小RNA(miRNA)等[3]。骨質(zhì)疏松與表觀遺傳關(guān)系密切[4]，DNA低甲基化狀態(tài)能提高成骨分化效率[5]，組蛋白去甲基化酶KDM4B能通過(guò)調(diào)節(jié)DLX基因族促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化[6]，miR-138通過(guò)抑制局部黏附激酶的表達(dá)阻礙成骨過(guò)程序[7]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松癥可能與體內(nèi) H3K9、H3K36甲基化升高有關(guān)，組蛋白去甲基化酶JMJD2 A、JMJD2B是骨質(zhì)疏松癥的潛在治療靶點(diǎn)之一[8]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為骨質(zhì)疏松的發(fā)生與腎虛存在密切關(guān)系[9]，研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎健骨中成藥仙靈骨葆對(duì)骨質(zhì)疏松具有較好的臨床療效[10]，目前缺少仙靈骨葆在表觀遺傳方面的研究，本研究觀察仙靈骨葆在去勢(shì)大鼠體內(nèi)防治骨質(zhì)疏松的潛在表觀遺傳學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與實(shí)驗(yàn)藥品

本次實(shí)驗(yàn)大鼠由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，通過(guò)動(dòng)物倫理批準(zhǔn)。12周齡的SPF級(jí)別雌性大鼠24只[許可證編號(hào)：SYXK(粵)2013-0001；質(zhì)量合格證編號(hào)：44005800008146]，體重(302±19) g，飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院SPF實(shí)驗(yàn)室，SD雌性大鼠適應(yīng)當(dāng)?shù)貏?dòng)物實(shí)驗(yàn)中心條件(溫度：24 ℃～26 ℃，濕度：67%，無(wú)菌狀態(tài)，每天12 h光明/黑暗)，大鼠自由獲取水和飼料。

藥物：仙靈骨葆膠囊由淫羊藿(加俄西)、地黃、丹參、川續(xù)斷(窩魁乃)等多種中藥制成，生產(chǎn)于貴州同濟(jì)堂制藥有限公司，藥品批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z20025337。福美加，生產(chǎn)于杭州默沙東制藥有限公司，藥品批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字J20130085。

1.2 主要儀器與試劑

1.2.1儀器：本實(shí)驗(yàn)所需儀器主要包括由Bio-Rad公司提供的熒光定量PCR儀器、電泳儀、逆轉(zhuǎn)錄儀、全能型凝膠成像系統(tǒng)；Thermo公司提供的多功能酶標(biāo)儀；Eppendorf公司提供的離心機(jī)；Leica公司提供的多功能自動(dòng)染色機(jī)、全自動(dòng)組織脫水，Merinton公司提供的微量核酸定量?jī)x，OLYPUS公司提供的研究型正置熒光生物顯微鏡，灰度分析軟件。

1.2.2試劑：本實(shí)驗(yàn)所需試劑主要包括由Genecopies公司提供的熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒(AOPR-1200)，DBI公司提供的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(DBI-2220)；弗德生物提供的BCA蛋白定量試劑盒(FD2001)；美國(guó)Sigma公司提供的伊紅液、蘇木精。引物設(shè)計(jì)為：JMJD2A：上游：5’-CTCTCCCTGGAGGAGAATAAGA-3’，下游：5’-GGTGTCAGCTGTTCAGAAGT-3’；H3：上游：5’-TCACTCAGGATGAATGGAAAGAG-3’，下游5’-CACCCATCCCTTCTGCATATA-3’；GAPDH(內(nèi)參)：上游：5’-AGTTCAACGGCACAGTCAAG-3’，下游：5’-TACTCAGCACCAGCATCACC-3’，上述引物由廣州四和生物科技有限公司提供。

1.3 動(dòng)物分組與造模

采用隨機(jī)數(shù)字表法將24只SD雌性大鼠分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組(6只/組)。陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠切除雙側(cè)卵巢，空白組大鼠僅去除卵巢周圍等量脂肪組織，術(shù)中及術(shù)后無(wú)大鼠死亡。1周后實(shí)驗(yàn)組予仙靈骨葆膠囊，陽(yáng)性對(duì)照組予福美加，參照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[11]，按大鼠-人等效給藥劑量換算，仙靈骨葆等效給藥劑量為30.85 mg/(100 g·d)，福美加等效給藥劑量為11.7 mg/(100 g·d)，空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組予等體積生理鹽水，給藥頻率：1次/d，6 d/周。大鼠每7天稱1次體重并記錄，根據(jù)最新大鼠體重計(jì)算各組給藥劑量，持續(xù)喂藥3個(gè)月。

1.4 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測(cè)

檢測(cè)指標(biāo)：RT-PCR檢測(cè)組蛋白H3和JMJD2A mRNA；Western blot檢測(cè)H3K36me3、H3K9me3和JMJD2A蛋白表達(dá)；HE染色觀察骨組織。

將50 mg左側(cè)股骨髁骨組織研成粉末狀后置入EP管內(nèi)，加入1 mL Trizol Reagent進(jìn)行冰浴，并持續(xù)勻漿30 min，取勻漿后上清液至新EP管內(nèi)，12 000 r/min離心15 min，上清液置入新EP管備用，提取總RNA。通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)組蛋白H3和JMJD2A mRNA表達(dá)。

向裝有50 mg左側(cè)股骨髁骨組織的EP管內(nèi)加入約10倍股骨組織體積RIPA裂解液，勻漿處理，獲取總蛋白并進(jìn)行定量，上樣、電泳與轉(zhuǎn)膜，孵育一抗、二抗、成像、分析灰度值，校準(zhǔn)采用β-actin為內(nèi)參蛋白，采用蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值來(lái)表示H3K36me3、H3K9me3和JMJD2A蛋白表達(dá)水平。

取右側(cè)股骨髁骨組織，沖洗，4%多聚甲醛液固定24 h以上，10%(w/v)EDTA脫鈣液中脫鈣約1個(gè)月，去酸、脫水、透明、浸潤(rùn)，石蠟包埋后切5 μm厚片。蘇木精和伊紅(HE)染色，顯微鏡下觀察(bx53，奧林巴斯公司，日本)，進(jìn)行描述性分析。

1.5 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析處理

收集數(shù)據(jù)并用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。采用方差齊性檢驗(yàn)，方差齊時(shí)采用單因素方差分析，方差不齊時(shí)采用非參數(shù)方差分析，多組間兩兩比較采取單因素方差分析LSD法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 股骨髁HE染色結(jié)果

40×鏡下觀察，與空白組相比較，陰性對(duì)照組骨小梁分布較紊亂，連續(xù)性較差，數(shù)目明顯減少，厚度降低。與陰性對(duì)照組相比較，實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組骨小梁連續(xù)性較好、排列較為整齊，骨小梁數(shù)量稍增多，骨小梁厚度增加。400×鏡下觀察，陰性對(duì)照組骨髓腔脂肪細(xì)胞明顯多于實(shí)驗(yàn)組、空白組及陽(yáng)性對(duì)照組。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠股骨髁骨組織HE染色 A：空白組；B：陰性對(duì)照組；C：實(shí)驗(yàn)組；D：陽(yáng)性對(duì)照組。Fig.1 HE staining in the femoral and condyle bones of rats in each group. A: Blank group; B: Negative control group; C: Experimental group; D: Positive control group.注：各組中顯微鏡(400×)圖像置于(40×)圖像右側(cè)。圖中箭頭標(biāo)示脂肪細(xì)胞。

2.2 仙靈骨葆對(duì)去勢(shì)大鼠組蛋白H3及JMJD2A mRNA表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組相比，陰性對(duì)照組JMJD2A mRNA表達(dá)明顯下降(P<0.05)，組蛋白H3mRNA表達(dá)水平明顯上升(P<0.05)。與陰性對(duì)照組相比較，實(shí)驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照J(rèn)MJD2A mRNA表達(dá)水平上升(P<0.05)，組蛋白H3mRNA表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)。陽(yáng)性對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組之間JMJD2A、組蛋白H3mRNA表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠JMJD2A、組蛋白H3 mRNA表達(dá)水平Fig.2 mRNA expression levels of JMJD2A and histone H3 in each group注：與陰性對(duì)照組比較，*P<0.05；與空白對(duì)照組比較，#P<0.05。

2.3 仙靈骨葆對(duì)去勢(shì)大鼠H3K36me3、H3K9me3、JMJD2A蛋白表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組比較，陰性對(duì)照組JMJD2A蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，H3K9me3、H3K36me3蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。與陰性對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照組JMJD2A蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，H3K9me3、H3K36me3蛋白表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)。陽(yáng)性對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組之間H3K36me3 蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 各組大鼠JMJD2A、H3K9me3、H3K36me3蛋白的表達(dá)水平Fig.3 Expression level of JMJD2A, H3K9me3, H3K36me3 proteins in each group注：與陰性對(duì)照組比較，*P<0.05；與空白對(duì)照組比較，#P<0.05。

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，骨質(zhì)疏松發(fā)病機(jī)制是骨重建時(shí)成骨-破骨之間的動(dòng)態(tài)平衡被改變[12]。骨質(zhì)疏松癥在中醫(yī)學(xué)范圍內(nèi)屬“骨痿”，病因病機(jī)以腎虛為本，脾虛為促進(jìn)因素[9]。仙靈骨葆膠囊主要由淫羊藿(加俄西)、地黃、丹參、川續(xù)斷(窩魁乃)等中藥組成，具有補(bǔ)腎益肝、強(qiáng)筋壯骨功效，是骨質(zhì)疏松癥首選中成藥制劑[13]。研究表明，仙靈骨葆可通過(guò)調(diào)節(jié)BMP-2、TIMP-1和PDGF的表達(dá)與PGI2和PGE2合成來(lái)提高骨質(zhì)疏松性骨折后骨密度[14]，可顯著降低骨周轉(zhuǎn)率、促進(jìn)成骨及抑制脂肪生成、促進(jìn)骨小梁結(jié)構(gòu)改善[15]，對(duì)骨吸收起抑制作用[16]。

組蛋白甲基化是將甲基轉(zhuǎn)移到賴氨酸殘基，賴氨酸存在不被修飾(me0)、一甲基化(me1)、二甲基化(me2)或三甲基化(me3)4種狀態(tài)，這些組蛋白甲基化狀態(tài)導(dǎo)致染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子獲得相關(guān)基因啟動(dòng)子來(lái)調(diào)控基因[17]。甲基化的調(diào)控受到組蛋白去甲基化酶和組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(KMTs)的雙向調(diào)節(jié)[18]。據(jù)報(bào)道，KMT1E/ESET能提升H3K9me3的表達(dá)水平[19]，并通過(guò)減少Runx2的轉(zhuǎn)錄活性來(lái)抑制成骨分化[20]。組蛋白去甲基化酶被分為兩類：賴氨酸特異性去甲基化酶家族和JmjC家族。KDMs從組蛋白賴氨酸殘基中去除甲基[21]，JmjC家族組蛋白去甲基化酶通過(guò)2OGFe(II)依賴的雙氧酶反應(yīng)催化去除甲基殘基，發(fā)揮生物學(xué)功能[22]。JMJD2A又叫作KDM4A，是一種組蛋白去甲基化酶，它可以催化H3K9me3和H3K36me3去甲基化，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活和抑制因子的作用[23-24]。組蛋白去甲基化酶KDM4B/KDM6B能調(diào)節(jié)骨形成相關(guān)基因Runx 2、AP-1、ATF 4、Smad等的表達(dá)，促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow derived mesenchymal stem cell，BMSCs)成骨性分化[25]，KDM4B和KDM6B通過(guò)消除 H3K9me3和H3K27me3甲基化修飾影響骨髓BMSCs向成骨細(xì)胞分化[6]。上述研究說(shuō)明JMJD2A能直接或間接通過(guò)組蛋白H3的第36和第9位點(diǎn)甲基化修飾影響成骨分化。

本研究結(jié)果表明，對(duì)比空白組，陰性對(duì)照組大鼠摘除卵巢后，HE股骨髁骨組織出現(xiàn)骨質(zhì)疏松病理特征，實(shí)驗(yàn)造模成功。陰性對(duì)照組中H3K9me3及H3K36me3表達(dá)增加，這與筆者前期研究結(jié)果存在一致性[8]。仙靈骨葆膠囊干預(yù)后，對(duì)比陰性對(duì)照組結(jié)果，去勢(shì)大鼠股骨髁骨組織中骨小梁結(jié)構(gòu)改善，髓腔內(nèi)脂肪細(xì)胞減少，JMJD2A高表達(dá)及H3K9me3和H3K36me3低表達(dá)。說(shuō)明仙靈骨葆膠囊對(duì)大鼠去卵巢后形成的骨質(zhì)疏松癥狀具有改善作用，能提高去勢(shì)大鼠骨組織中組蛋白去甲基化酶JMJD2A表達(dá)量，抑制H3K9me3、H3K36me3水平。

綜上所述，仙靈骨葆膠囊能參與去勢(shì)大鼠組蛋白修飾，其治療骨質(zhì)疏松癥的潛在機(jī)制可能通過(guò)提高JMJD2A表達(dá)，抑制H3K9me3、H3K36me3表達(dá)實(shí)現(xiàn)，為解釋仙靈骨葆膠囊在抗骨質(zhì)疏松治療中的表觀遺傳機(jī)制提供了一定的前期基礎(chǔ)，但JMJD2A調(diào)控成骨-破骨平衡的機(jī)制暫不明確，仍需更深層次研究。