甲狀旁腺素聯合雌二醇對大鼠骨質疏松的影響

徐偉軍 王明新 夏文強

1．北京核工業醫院房山院區骨科，北京102488

2．中國人民解放總醫院第三臨床中心關節四肢科，北京100039

3．北京豐臺醫院骨科，北京100071

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是以骨量減少、骨微結構破壞、骨脆性增加、骨折風險升高為特征的全身代謝性骨病。骨質疏松性骨折(osteoporotic fracture，OPF)是OP最嚴重的并發癥，骨質疏松患者一旦發生骨折，生活質量急劇下降，給家庭和社會帶來沉重的經濟負擔［1］。因此，OP的預防比治療更為現實和重要。雌激素缺乏被認為是導致OP的重要原因之一，雌激素替代療法(estrogen replacement theropy，ERT)目前是防治OP的治療方案之一［2］。甲狀旁腺素(parathyroid hormone，PTH)是由甲狀旁腺主細胞合成分泌，作為調節鈣、磷代謝水平的生物活性物質，可調節骨的合成和分解代謝，對成骨細胞和破骨細胞的分化、成熟、凋亡發揮重要作用［3］。PTH已在中國獲批用于治療有骨折高發風險的絕經后婦女骨質疏松癥(PMO)。因此，本研究試圖探討甲狀旁腺素聯合雌二醇對去卵巢大鼠骨質疏松的治療作用，為臨床治療OP提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

SPF級雌性SD大鼠100只，10周齡，體重180～270 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司［許可證號:SYXK(京)2017－0033］;重組人甲狀旁腺激素(1－34)(100 μg/支，批號:1708072，美國Sigma公司);苯甲酸雌二醇注射液(1 mg/支，批號:1711104，上海通用藥業股份有限公司);Ca、P、ALP試劑盒(批號:201835，南京建成生物工程公司);大鼠COL－I、OC、OPG 試劑盒(批號:201709，美國 R﹠D公司);全自動生化分析儀(型號:7 170 A，日本日立公司);雙能X線骨密度測定儀(型號:LUNAR－Prodigy，美國GE公司);生物力學實驗機(型號:MTS－858，美國 MA 公司)。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及處理:將100只雌性SD大鼠按隨機數字法分為假手術組、去勢組、甲狀旁腺素組、雌二醇組、聯合用藥組，每組20只。假手術組僅切除部分脂肪組織，去勢組、甲狀旁腺素組、雌二醇組、聯合用藥組均行雙側卵巢切除術。造模成功后第2天給予藥物干預:假手術組、去勢組皮下注射0.9%氯化鈉，每日1次;甲狀旁腺素組皮下注射PTH(1－34)50 μg/kg，每日1次;雌二醇組肌肉注射苯甲酸雌二醇1 mg，每兩日1次;聯合用藥組皮下注射PTH(1－34)50 μg/kg，每日 1 次，肌肉注射苯甲酸雌二醇1 mg，每兩日1次。

1.2.2 構建動物模型:參照駱陽等［4］構建去卵巢大鼠骨質疏松性骨折模型方法。造模成功后第2天給予各組藥物干預，各組大鼠均分籠飼養，標準飼料，自由飲水，照明、通風、溫度、濕度等飼養環境條件均相同。

1.2.3 標本取材與處理:給藥干預6周后，采用快速心臟急性大失血法處死大鼠，取血約5 mL，3 000 r/min，離心10 min，收集上層血清，－20℃保存備用，待骨代謝生化指標和標志物檢測。逐層剝離大鼠L4腰椎和股骨，以無菌生理鹽水濕紗布包裹置于－20℃的冰箱保存備用，以行腰椎、股骨骨密度和生物力學檢測。另留取股骨經0.9%氯化鈉沖洗后置于10%甲醛溶液中固定，經10%EDTA處理6周，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制成5 μm厚切片，置于60℃烤箱4 h，取出室溫保存備用。

1.2.4 骨組織骨密度測定:取出待測大鼠L4腰椎和右側股骨，通過LUNAR雙能X線吸收掃描儀測量，采用小物體掃描模式，以分辨率1.0 mm×1.0 mm、掃描速度60 mm/s、掃描寬度5.0 cm的參數值，用儀器選定興趣區，以2.0 mm×2.0 mm為中心區域，讀出骨密度值。

1.2.5 大鼠骨生物力學檢測:將大鼠右側股骨置于MTS－858型電子生物力學材料試驗機進行三點彎曲力學試驗，儀器調試正常后固定骨標本在同一位置，以右股骨橫切面為準，以中點為加壓點，支點跨距為20 mm，加載速度2 mm/min，給予股骨載荷，計算機記錄儀記錄載荷位移曲線，測定生物力學變化，骨生物力學包括最大載荷和剛度。

1.2.6 骨代謝相關生化指標檢測:取出上清液，采用7 170 A全自動生化分析儀免疫比濁法檢測相關生化指標:血鈣(Ca)、血磷(P)、血堿性磷酸酶(ALP)，均按試劑盒說明書步驟操作。室溫平衡，標準品稀釋，加樣，溫育，稀釋，洗滌，顯色，終止反應，制備標準曲線，計算出血清Ca、P、ALP濃度。

1.2.7 骨代謝標志物檢測:采用ELISA法測定血清COL－I、OC、OPG含量，參照試劑盒說明書進行操作。試劑盒室溫平衡，標準品稀釋，加入標準品及樣品，37℃溫育，稀釋配液，洗滌液洗滌，顯色劑顯色，終止反應，以空白組調零、450 nm波長依序測量各孔的吸光度值(OD值)，制備標準曲線，計算出血清COL－I、OC、OPG 的濃度。

1.2.8 HE染色:取出切片，脫蠟，水化，沖洗，蘇木精染色，流水沖洗，鹽酸酒精分化，流水沖洗，返藍，蒸餾水洗滌，伊紅染色，流水沖洗，脫水，透明，封片，光鏡下觀察染色并采集圖片。

1.3 統計學分析

應用SPSS 20.0軟件進行分析，實驗數據采用“珋x±s”表示，統計學分析采用單因素方差分析，組間比較采用 SNK法，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 骨組織骨密度

去勢組腰椎(L4)和股骨骨密度(bone mineral density，BMD)較假手術組顯著降低(P＜0.05)，甲狀旁腺素組、雌二醇組、聯合用藥組腰椎(L4)和股骨BMD均較去勢組增高，其中以聯合用藥組增高最為顯著(P＜0.05)。見表1。

表1各組大鼠腰椎和股骨BMD比較(珋x±s)Table 1 Comparison of BMD of lumbar vertebrae and femur between each group(珋x±s)

2.2 骨生物力學

去勢組股骨最大載荷和剛度較假手術組顯著降低(P＜0.05)，甲狀旁腺素組、雌二醇組、聯合用藥組股骨最大載荷和剛度均較去勢組顯著增高，其中尤以聯合用藥組增高最為顯著(P＜0.05)。見表2。

表2各組大鼠股骨生物力學比較(珋x±s)Table 2 Comparison of femur biomechanical parameters between each group(珋x±s)

2.3 骨代謝相關生化指標

去勢組血清 Ca、P顯著低于假手術組(P＜0.05)，甲狀旁腺素組、雌二醇組、聯合用藥組血清Ca、P均高于去勢組，其中尤以聯合用藥組增高最為顯著(P＜0.05);去勢組血清ALP顯著高于假手術組(P＜0.05)，甲狀旁腺素組、雌二醇組、聯合用藥組血清ALP較去勢組降低，其中尤以聯合用藥組降低最顯著(P＜0.05)。見表3。

表3各組大鼠血清骨代謝指標比較(珋x±s)Table 3 Comparison of serum bone metabolism markers between each group(珋x±s)

2.4 骨代謝標志物

去勢組血清COL－I、OC、OPG顯著高于假手術組(P＜0.05)，甲狀旁腺素組、雌二醇組、聯合用藥組血清COL－I、OC、OPG均較去勢組降低，其中尤以聯合用藥組降低最顯著(P＜0.05)。見表4。

表4各組大鼠血清骨代謝標志物比較(珋x±s)Table 4 Comparison of serum bone metabolism markers between each group(珋x±s)

2.5 骨組織病理學

假手術組骨組織結構完整，現大量骨小粱，致密粗壯，形態規則，連接較好，排列齊整。去勢組骨組織呈骨質疏松特征性表現，骨小梁少見，細小稀疏，小梁間斷裂分離，間隙增大，排列疏松紊亂，骨板層結構疏松。甲狀旁腺素組和雌二醇組骨組織結構相對較完整，骨小梁變粗變密，形態相對規則，連續性較好，排列尚規則致密，且骨小梁數多于去勢組。聯合用藥組骨組織結構完整，大量骨小梁，致密均勻粗壯，形態結構規整，連續性好呈網狀，結構致密。見圖1。

圖1HE染色觀察骨組織的形態結構變化(×200)A:假手術組;B:去勢組;C:甲狀旁腺素組;D:雌二醇組;E:聯合用藥組。Fig．1 Observation of morphological changes of bone tissue by HE staining(×200)

3 討論

雌激素水平降低是導致OP的重要原因之一，主要機制為雌激素缺乏導致成骨細胞和破骨細胞的比例失衡，骨轉換加快，骨吸收增強，骨形成減少，骨量丟失，導致OP發生［5］。雌激素可以抑制骨質疏松性骨量丟失［6］。雌激素在骨代謝方面起著重要作用，應用 ERT和選擇性雌激素受體調節劑(SERM)是防治OP、減少OPF發生的有效措施［7］。

雌激素抗骨質疏松作用主要是通過抑制破骨細胞骨吸收和促進成骨細胞骨形成實現的，雌激素可通過鈣調節激素間接對骨骼起作用，促進降鈣素的分泌，降低破骨細胞活性，降低骨對PTH敏感性，抑制骨吸收，增強肝臟25－羥化酶和腎臟1α－羥化酶的活性，增加1，25－(OH)D3的生成與活性，促進鈣吸收［8］;又可通過作用于成骨細胞雌激素受體(ER)，激發成骨細胞活性，增加骨量骨密度，提高骨質量，發揮骨暈影響效應，打破成骨與破骨效應平衡環境［9］。同時還可通過抑制白介素－1、白介素－6、腫瘤壞死因子等細胞因子合成和分泌，抑制骨吸收，促進轉化生長因子－R(TGF－R)及胰島素樣生長因子－I(IGF－1)增加，促進骨形成［10］。

PTH是骨代謝過程中調節血鈣、血磷水平重要的調節因子［11］。PTH可精細調節骨的合成和分解代謝，對成骨細胞和破骨細胞的分化、成熟、凋亡發揮雙重調節作用，不僅可增加成骨細胞數量，促進成骨細胞釋放骨生長因子，增加骨量，提高骨密度，促進骨形成;而且也可通過增強破骨細胞活性，促進骨吸收，使骨鈣釋放入血［12］。同時PTH還可誘導成骨細胞分化，促進膠原合成和骨組織礦化，抑制成骨細胞凋亡［13］。此外，PTH還能增加遠球小管對鈣的重吸收，減少近球小管對血磷的重吸收，從而升高血鈣，降低血磷［14］。PTH(1－34)是 PTH 中具有活性的氨基酸序列，PTH(1－34)能顯著升高骨密度，增加骨量，改善骨結構，刺激骨形成，降低骨折發生率，在臨床骨質疏松治療中具有重要的應用價值。

本研究結果表明去勢組腰椎和股骨BMD、股骨最大載荷和剛度及血清Ca、P水平均較假手術組顯著降低(P＜0.05)，而聯合用藥組上述指標均較去勢組顯著增高(P＜0.05)。去勢組血清 ALP、COL－I、OC、OPG水平較假手術組顯著增高(P＜0.05)，而聯合用藥組上述指標均較去勢組顯著降低(P＜0.05)。去勢組骨組織呈骨質疏松特征性表現，骨小梁少見，細小稀疏，小梁間斷裂分離，間隙增大，排列疏松紊亂，骨板層結構疏松;聯合用藥組骨組織結構完整，大量骨小梁，致密均勻粗壯，形態結構規整，連續性好呈網狀，結構致密。楊力等［15］的研究表明雌激素和PTH可使去卵巢大鼠松質骨骨量增加、改善生物力學性能，兩者聯合治療具有協同作用。梁敏等［16］證實雌二醇和左炔諾孕酮聯合應用可增加骨密度，降低骨轉換率。

綜上所述，甲狀旁腺素聯合雌二醇可調節維持骨質疏松性骨代謝，提高骨密度，改善骨生物力學性能和骨組織病理形態學，促進骨形成，抑制骨吸收，起到骨保護作用，兩者聯合治療具有協同治療骨質疏松作用。