病程相關(guān)蛋白在采后果蔬誘導(dǎo)抗病性中的研究進(jìn)展

焦文曉，王曉梅，范新光，姜微波

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

采后貯藏過程中，由于果蔬的成熟和衰老，其抗病性逐漸降低，因而極易受到病原菌侵染而導(dǎo)致腐爛。據(jù)報道，發(fā)達(dá)國家每年約有20%的果蔬損失于采后腐爛，發(fā)展中國家每年約有50%的果蔬損失于采后貯運(yùn)環(huán)節(jié)[1]。為了減少采后病害和經(jīng)濟(jì)損失，目前控制采后病害的主要手段是使用化學(xué)殺菌劑，但因其易造成化學(xué)殘留、引起環(huán)境污染、危害人類健康，并且誘導(dǎo)病原物產(chǎn)生抗藥性等問題而逐漸受到限制。隨著植物誘導(dǎo)抗病理論和技術(shù)的進(jìn)步，誘導(dǎo)抗病性已成為一種安全、有效的采后病害控制措施。利用物理、化學(xué)以及生物激發(fā)子誘導(dǎo)果實(shí)病程相關(guān)蛋白的基因表達(dá)，導(dǎo)致病程相關(guān)蛋白的積累，從而使果蔬具備了比未誘導(dǎo)果蔬更快更強(qiáng)的表達(dá)防衛(wèi)反應(yīng)以應(yīng)對生物與非生物脅迫的能力，這也是著名的“priming”抗病機(jī)制。研究報道，抗病蛋白的積累是植物系統(tǒng)獲得抗性（Systemic acquired resistance,SAR）被誘導(dǎo)的標(biāo)志[2]。目前，尚未見有關(guān)病程相關(guān)蛋白在采后果蔬誘導(dǎo)抗病性中的綜合分析報道。本文重點(diǎn)綜述了果蔬病程相關(guān)蛋白的分類、功能、誘導(dǎo)表達(dá)，以及蛋白組學(xué)技術(shù)在果蔬采后PRs表達(dá)水平上的應(yīng)用，旨在為果蔬病程相關(guān)蛋白的研究提供有益的借鑒和參考。

1 病程相關(guān)蛋白的分類及功能

早在1970年，Gianinazzi等用煙草花葉病毒（TMV）感染煙草后，發(fā)現(xiàn)葉片中能產(chǎn)生一種或者多種低分子量的蛋白質(zhì)，后在1980年被Antoniw等命名為“病程相關(guān)蛋白”（Pathogenesis-related proteins，簡稱 PRs）。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，PRs廣泛存在于高等植物中，具有相對低的分子量，穩(wěn)定性較大，多存在于胞間等特點(diǎn)，是植物中研究較為深入的生化抗病因子。根據(jù)其生物活性和血清學(xué)關(guān)系將PRs分為17個家族[2]，目前在采后病害防治的研究已涉及多種水果和蔬菜（表1）。

表1 果蔬中的病程相關(guān)蛋白家族Table 1 Families of pathogenesis-related proteins in fruits and vegetables

PR1最初在TMV侵染煙草抗病反應(yīng)中產(chǎn)生，PR1過表達(dá)能提高植物抗TMV能力，在植物防御反應(yīng)中起重要作用，是病原菌誘導(dǎo)SAR產(chǎn)生的標(biāo)記，但是其生物活性還沒有被闡述[28]；PR2具有β-1,3葡聚糖酶活性，能夠降解β-1,3葡聚糖苷，破壞真菌細(xì)胞壁；PR3、PR4、PR8、PR11 都屬于內(nèi)切幾丁質(zhì)酶家族蛋白，能夠抵御真菌侵染，另外，PR8還具有溶菌酶活性，可直接作用于細(xì)菌，減輕病害[2]；PR5類甜蛋白是一種具有多種生物學(xué)活性及重要功能的植物防御蛋白，具有β-1,3葡聚糖酶活性，能夠結(jié)合β-1,3葡聚糖苷，從而降解真菌細(xì)胞壁，具有抗菌活性[29]；PR6具有蛋白酶抑制劑活性，同時PR6和幾丁質(zhì)酶都可抵御線蟲和食草性昆蟲[2]；PR7具有內(nèi)切蛋白酶活性，是西紅柿中最顯著的抗病蛋白，對真菌細(xì)胞壁有一定溶解作用[23]；PR9是典型的過氧化物酶，能夠通過催化組織木質(zhì)化從而使細(xì)胞壁增厚，增強(qiáng)對多種致病菌的抗性[30]；PR10與核糖核酸酶具有相似結(jié)構(gòu)，部分PR10在體外具有核糖核酸酶的活性和抗菌活性，可抵御病毒侵染[31]，最近研究顯示PR4也具有核糖核酸酶的活性[32]；防御素（PR12）和硫堇化合物（PR13）具有細(xì)胞膜通透性，能使真菌或者細(xì)菌病原體質(zhì)壁分離，阻止其生長繁殖，PR12、PR13和PR14都具有廣泛的抗細(xì)菌和抗真菌的活性[33-35]；PR15、PR16最近被加入PRs家族，存在于單子葉植物，屬于草酸氧化酶和類草酸氧化酶，具有萌發(fā)素活性，能使細(xì)胞壁再塑，從而阻止病原物的入侵，部分PR15、PR16具有超氧化物歧化酶活性，通過催化超氧陰離子和水，產(chǎn)生過氧化氫，而過氧化氫可對病原菌產(chǎn)生毒性或者作為信號分子刺激植物產(chǎn)生抗性響應(yīng)[36-37]；在感染的煙草、大麥和小麥中發(fā)現(xiàn)一種PR17，有類似于含鋅蛋白酶活性位點(diǎn)序列，但其生物活性尚不清楚[38]。

2 激發(fā)子誘導(dǎo)PRs表達(dá)

人們首先發(fā)現(xiàn)植物受到病蟲害侵染后能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生自然抗性反應(yīng)（Natural disease resistance，NDR），并將這種抗性稱為誘導(dǎo)抗性（Induced resistance）。激發(fā)子是一類能激活宿主植物產(chǎn)生防衛(wèi)反應(yīng)的特殊化合物，一般包括物理激發(fā)子（如熱處理、紫外線照射、電離輻射等）、化學(xué)激發(fā)子（水楊酸、茉莉酸甲酯、草酸、硅等）和生物激發(fā)子（主要是生物拮抗菌等），一些激發(fā)子不僅能夠激活宿主自身抗性系統(tǒng),而且能夠誘導(dǎo)果實(shí)PRs的表達(dá)。

2.1 物理誘導(dǎo)PRs

熱處理可通過殺死或者抑制病原菌的生長，從而達(dá)到防腐保鮮的目的[39]。研究表明，熱處理可通過誘導(dǎo)積累PRs，進(jìn)而提高果蔬自身抗性的作用。陳麗等[7]用52℃熱水處理香蕉3 min后發(fā)現(xiàn)，熱水處理誘導(dǎo)了香蕉果皮幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶等病程相關(guān)蛋白酶活性的升高。Wang等[8]發(fā)現(xiàn)熱激處理后的楊梅果實(shí)幾丁質(zhì)酶、β-1,3-葡聚糖酶及POD活性都顯著提高。低劑量的短波紫外輻射（波長190~280 nm）能夠控制采后病害，減少果實(shí)腐爛。紫外燈照射桃果實(shí)可快速誘導(dǎo)果實(shí)幾丁質(zhì)酶、β-1,3-葡聚糖酶等病程相關(guān)蛋白的積累，并在處理后96 h達(dá)到最大值[10]。

2.2 化學(xué)誘導(dǎo)PRs

水楊酸作為一種重要的內(nèi)源性信號分子，可以誘導(dǎo)特定的抗性生理反應(yīng)以及抗性蛋白的表達(dá)。Xu等[12]采用外源水楊酸處理甜櫻桃發(fā)現(xiàn)，果實(shí)幾丁質(zhì)酶、β-1,3-葡聚糖酶顯著提高，且誘導(dǎo)了幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)。Qin等[40]研究發(fā)現(xiàn)，將甜櫻桃果實(shí)在0.5 mmol/L水楊酸溶液中增壓（103 kPa）浸泡4 min，可顯著提高低溫貯藏期間β-1,3-葡聚糖酶的活性。Zeng等[41]報道了1 mmol/L水楊酸處理芒果后，果實(shí)β-1,3-葡聚糖酶活性明顯高于對照組，從而減少了果實(shí)炭疽病的發(fā)生，并減緩了病斑直徑的擴(kuò)展。

S-甲基苯并[1,2,3]噻二唑-7-硫代羧酸酯（BTH）是第一個人工合成并且商品化的化學(xué)激發(fā)劑，屬于水楊酸類似物，能夠誘導(dǎo)植物SAR基因并積累PRs[14,42]。研究報道，一些低聚果糖如牛蒡低聚果糖能夠誘導(dǎo)水楊酸途徑從而誘導(dǎo)果實(shí)產(chǎn)生SAR。Sun等[4]研究了牛蒡低聚果糖處理葡萄誘導(dǎo)了果實(shí)PR1基因的表達(dá)，并且增強(qiáng)PRs（幾丁質(zhì)酶和β-1,3葡聚糖酶）酶活性，從而誘導(dǎo)了果實(shí)水楊酸依賴的抗病途徑。

茉莉酸類物質(zhì)是植物天然合成的介導(dǎo)生物脅迫和非生物脅迫的一類信號分子，在植物成熟和果實(shí)發(fā)育過程中起重要作用，典型代表有茉莉酸和茉莉酸甲酯。Yao等[13]研究發(fā)現(xiàn)，采前用2 mmol/L水楊酸和0.2 mmol/L茉莉酸甲酯分別處理甜櫻桃果實(shí)，能夠顯著誘導(dǎo)兩種PRs（β-1,3-葡聚糖酶和過氧化物酶）的活性，從而抑制真菌病害。Wang等[43]研究發(fā)現(xiàn)，茉莉酸甲酯處理可激發(fā)楊梅果實(shí)的“priming”響應(yīng)，并且誘導(dǎo)果實(shí)幾丁質(zhì)酶活性的增強(qiáng)。許多研究證明，殼聚糖和殼寡糖對采后果蔬多種病原菌的繁殖和生長都有抑制作用，能誘導(dǎo)果蔬抗病性的增強(qiáng)，同時促進(jìn)PRs（主要是幾丁質(zhì)酶、β-1,3-葡聚糖酶和過氧化物酶）活性的提高[24,44]。此外，Chen等[45]研究證明殼寡糖能誘導(dǎo)植物病程相關(guān)蛋白基因PR1、PR10、幾丁質(zhì)酶及β-1,3-葡聚糖酶基因的表達(dá)。

2.3 生物誘導(dǎo)PRs

利用生物拮抗菌減輕果蔬采后病害具有巨大的潛力，它們通過產(chǎn)生對病原菌生長有抑菌作用的物質(zhì)，或者通過快速生長繁殖在寄主傷口處競爭營養(yǎng)和空間，或者誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生抗性相關(guān)蛋白酶（主要包括PRs家族和酚類代謝的一些酶）等方式來提高果蔬抗病性。Xu等[11]用四種酵母拮抗菌（Pichia membranaefaciens,Cryptococcus laurentii,Candida guilliermondii和Rhodotorula glutinis）處理桃果實(shí)，顯著減輕了Monilinia fructicola引起的真菌病害，拮抗菌提高了兩個PR蛋白（幾丁質(zhì)酶和β-1,3葡聚糖酶）活性，并且誘導(dǎo)了相關(guān)基因的表達(dá)。Liu等[18]研究發(fā)現(xiàn)致病菌（Botrytis cinerea）和拮抗酵母（Candida oleophila）侵染蘋果果實(shí)時PR8基因表達(dá)明顯上升，而PR5基因卻沒有。El-kereamy等[25]用病原菌Momilinia fructicola處理李子，發(fā)現(xiàn)處理后果實(shí)PR10基因表達(dá)量上調(diào)。

2.4 結(jié)合誘導(dǎo)PRs

不同激發(fā)子的結(jié)合使用具有廣闊的應(yīng)用前景。用2%CaCl2(m/V)和酵母拮抗菌（Pichia membranifaciens）分別或者結(jié)合處理荔枝果實(shí)，結(jié)合處理的果實(shí)中兩個PR蛋白（幾丁質(zhì)酶和β-1,3葡聚糖酶）活性分別高于單獨(dú)處理組，且可明顯抑制果實(shí)炭疽病引起的腐爛[16]。Liu等[17]采用38℃熱空氣處理荔枝果實(shí)36 h或者用拮抗菌Pichia guilliermondii處理果實(shí)，二者都顯著誘導(dǎo)了PR蛋白β-1,3-葡聚糖酶的積累，研究發(fā)現(xiàn)兩種方式結(jié)合處理效果最好，且β-1,3-葡聚糖酶活性最高。Guo等[20]在研究茉莉酸酯和拮抗酵母處理柑橘果實(shí)后，其PR5基因的表達(dá)量顯著高于單獨(dú)處理和對照處理，說明了PR5基因能夠被誘導(dǎo)表達(dá)并且積累蛋白從而提高果實(shí)抗性。乙烯利處理香蕉能夠誘導(dǎo)果實(shí)PR1基因的表達(dá)，BTH和茉莉酸甲酯單獨(dú)處理時卻沒有誘導(dǎo)PR1基因表達(dá)，而研究乙烯利、BTH和茉莉酸甲酯三者結(jié)合處理香蕉，可明顯觀察到果實(shí)PR1基因表達(dá)上升，結(jié)果證明了BTH和茉莉酸甲酯依賴乙烯誘導(dǎo)途徑誘導(dǎo)香蕉抗性[5]。

綜上所述，目前對于激發(fā)子誘導(dǎo)的病程相關(guān)蛋白主要集中在幾丁質(zhì)酶、β-1,3葡聚糖酶以及過氧化物酶的研究，也有部分關(guān)于PR5、PR10等病程相關(guān)蛋白的研究。由于受到蛋白酶活檢測手段的限制，對于其他PRs的研究主要依靠分子生物手段，即研究其基因的表達(dá)。但是因?yàn)榘被釟埢N類遠(yuǎn)多于核苷酸殘基，而且蛋白質(zhì)有著復(fù)雜的翻譯后修飾（磷酸化和糖基化等），所以對于果蔬中存在的其他病程相關(guān)蛋白及它們在果蔬采后抗病過程中誘導(dǎo)表達(dá)作用的研究可借助于蛋白組學(xué)技術(shù)。

3 利用蛋白組學(xué)技術(shù)研究果實(shí)采后病程相關(guān)蛋白的表達(dá)

近幾年隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究的發(fā)展，利用該技術(shù)研究采后果蔬病害防御過程中抗病蛋白的變化已成為熱點(diǎn)。早期的蛋白組學(xué)技術(shù)以雙向凝膠電泳-質(zhì)譜技術(shù)為主，用來分析蛋白的表達(dá)，現(xiàn)代蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白分離主要有基于凝膠和色譜分離兩大技術(shù)體系，前者包括經(jīng)典的雙向電泳（Two-dimensional electrophoresis,2-DE）和新型的雙向熒光差異凝膠電泳技術(shù)（Two-dimensional fluorescent difference gel electrophoresis,2D-DIGE），后者包括同位素親和標(biāo)簽（Isotopecoded affinity tag,iCAT）和同位素標(biāo)記相對和絕對定量（Isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ）技術(shù)。此外，還有蛋白質(zhì)芯片（Protein chip）技術(shù)和毛細(xì)管電泳（Capillary electrophoresis）技術(shù)等。

Chan等[46]利用雙向電泳技術(shù)研究了生防菌和水楊酸處理桃果實(shí)后蛋白質(zhì)組的變化。鑒定了25個差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，包括參與蛋白質(zhì)代謝、防御反應(yīng)、能量代謝和細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)的蛋白質(zhì)。其中，6個抗氧化蛋白質(zhì)和3個PR蛋白質(zhì)被拮抗酵母或水楊酸誘導(dǎo)。研究報道利用蛋白組學(xué)技術(shù)分析灰霉菌污染的西紅柿果實(shí)的蛋白組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，綠熟西紅柿相比于紅熟西紅柿和不能成熟的綠熟果實(shí)，其中所含的抗性相關(guān)蛋白較少[47]。Yao等[48]利用電泳分離和質(zhì)譜鑒定技術(shù)研究葡萄與灰霉菌互作，篩選到PR類蛋白、NBSLRR類等多種抗病相關(guān)蛋白。Fan等[49]利用iTRAQ技術(shù)比較了對照組甜橙、感病品種與抗病品種的蛋白變化情況，共鑒定出了686個蛋白，其中與外界脅迫相關(guān)的蛋白（主要是PRs）發(fā)生顯著上調(diào)。雙向電泳技術(shù)是目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究的主要方法，然而該技術(shù)存在操作復(fù)雜，蛋白檢測范圍有限等問題，而逐漸被一些新的技術(shù)所取代。iTRAQ技術(shù)作為一種新的功能強(qiáng)大的分析蛋白技術(shù)，與傳統(tǒng)技術(shù)相比，不僅可以發(fā)現(xiàn)并檢出低豐度蛋白、強(qiáng)堿性蛋白、小于10 kD或者大于200 kD的蛋白，而且可標(biāo)記所有酶解肽段，提高了蛋白質(zhì)鑒定的覆蓋率和可信度等。隨著基因組和植物蛋白數(shù)據(jù)庫的不斷完善，iTRAQ技術(shù)在果蔬采后病理學(xué)中的應(yīng)用方面將會發(fā)揮更大的潛力。

4 展望

目前對于病程相關(guān)蛋白的研究多集中在植物體上，由于果實(shí)采后的表達(dá)與植物本身的抗性表達(dá)會有很大差異，所以有關(guān)果實(shí)采后病程相關(guān)蛋白的研究還需要大量的工作。①在誘導(dǎo)果實(shí)PRs激發(fā)子的研究方面，尋找新型、高效、無毒的激發(fā)子或結(jié)合激發(fā)子，并提高蛋白質(zhì)檢測手段（如運(yùn)用蛋白組學(xué)技術(shù)），闡明激發(fā)子誘導(dǎo)果實(shí)抗性，積累抗性蛋白的機(jī)制，這在提高采后果蔬的抗病能力方面具有重要的理論指導(dǎo)意義；②對于PRs生物功能的研究方面，進(jìn)一步闡明PRs在果蔬采后抗病過程中的重要作用，解析病程相關(guān)蛋白的其他生物學(xué)性質(zhì)，如已有研究報道一些PRs是果蔬過敏原的主要來源，據(jù)報道PR14是桃、梨和甜橙等水果的主要過敏原，PR10基因是草莓和蘋果的過敏原基因，而蘋果、櫻桃中的PR5也可導(dǎo)致過敏等[27]；③對果蔬PRs結(jié)構(gòu)性質(zhì)的研究方面，已經(jīng)報道不同類群內(nèi)的病程相關(guān)蛋白的基因高度分化，同一類群PRs基因也都有不同的類型，那么果蔬中所含有的不同類型的PRs是否具有相近的功能，或者說的不同分支PRs是否具有不同的生理功能，這仍然是一個需要深入研究的課題。