青麥仁凍藏期內(nèi)菌相分析及優(yōu)勢菌的分離鑒定

高玲玲，張康逸，何夢影，康志敏，溫青玉，趙 迪

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)副產(chǎn)品加工研究中心，河南 鄭州 450002）

青麥仁是指在乳熟后期、蠟熟期收獲的小麥粒，此時期的麥仁雖已飽滿但尚未成熟，呈淺青色或碧綠色。與成熟小麥相比，青麥仁具有獨特的口味和特殊的香氣，且其含有豐富的蛋白質(zhì)、膳食纖維和α、β兩種淀粉酶，具有幫助人體消化、降低血糖的功能[1-2]，深受消費者喜愛。近年來，隨著人民生活水平的提高和膳食結(jié)構(gòu)的改善，青麥仁市場需求量逐年增加，市場前景廣闊。

一般情況下，小麥安全貯藏的含水量為12%~14%[3]。而青麥仁季節(jié)性強、收獲期短、含水量高，不適宜常溫貯藏。速凍能較好地保持其原有的色澤、香氣及營養(yǎng)價值[4]，是鮮食谷物類產(chǎn)品加工和貯藏的重要方式之一[5-6]。但由于青麥仁營養(yǎng)豐富，水分活度較高，在收獲后進行加工和冷凍貯藏過程中，一旦條件適宜其殘留的微生物就會迅速生長繁殖，導(dǎo)致青麥仁腐敗，產(chǎn)生諸如色澤、風(fēng)味的改變，甚至營養(yǎng)成分被破壞等不同程度的品質(zhì)問題[7-9]。因此，對速凍青麥仁中的菌相進行分析以及探討引起青麥仁腐敗變質(zhì)的優(yōu)勢微生物的種類、數(shù)量等，不僅能夠了解和掌握速凍青麥仁加工與速凍過程中的優(yōu)勢菌群，為青麥仁防腐抑菌試驗提供目標(biāo)菌，同時也可以為青麥仁腐敗變質(zhì)機制的分析和腐敗菌控制措施的制定提供理論依據(jù)。

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，食品貯藏過程中易受細(xì)菌和霉菌的影響[10-11]。但關(guān)于凍藏期食品菌相的研究報道多集中在米面制品、肉類、奶類及水產(chǎn)等[12-15]，對于凍藏期內(nèi)鮮食谷物菌相及優(yōu)勢菌的研究則未見報道。本研究以凍藏期內(nèi)的青麥仁為對象，在傳統(tǒng)分離方法的基礎(chǔ)上，分析速凍青麥仁的菌相，并結(jié)合16S rDNA對優(yōu)勢菌株進行鑒定，研究青麥仁凍藏期內(nèi)優(yōu)勢菌株出現(xiàn)的可能性，對青麥仁貯藏保鮮、貨架期預(yù)測及生物控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

貯藏于-20℃的速凍青麥仁：由本實驗室提供。

PCA培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、改良MC培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、YNA培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基、明膠培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、蛋白胨、酵母浸粉、葡萄糖、瓊脂、硫酸鎂、碳酸鈣，購于北京奧博星生物技術(shù)有限公司；磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、氯化鈉、無水乙醇，購于天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心；DNA純化試劑盒，購于北京百泰克生物技術(shù)有限公司；引物合成，生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱，SW-CJ-1bu型潔凈工作臺，YXQ-LS-50S11型高壓滅菌鍋，HNY-2102C型恒溫培養(yǎng)振蕩器，BCD-202TD型冰箱，XSP-BM-2MC型顯微鏡，HH-S2型恒溫水浴槽，JB/T5374型電子天平，ABI-2720型PCR儀。

1.2 方法

利用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法和菌落PCR技術(shù)進行青麥仁凍藏期內(nèi)微生物種類及優(yōu)勢菌的分析。

1.2.1 樣品的預(yù)處理

將貯藏于-20℃的青麥仁取出后在無菌超凈臺內(nèi)分裝成10 g/份的樣品后立即進行各項指標(biāo)測定，所用器具均經(jīng)過高溫殺菌。

1.2.2 菌相分析

利用選擇性培養(yǎng)基對速凍青麥仁中的細(xì)菌、乳酸菌、芽孢桿菌、霉菌酵母菌進行平板計數(shù)，培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件見表1。

表1 不同菌相的選擇性培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件Table 1 Incubation conditions and selective media for different microflora

1.2.2.1 速凍青麥仁菌相的分離純化

稱取青麥仁10 g，加入90 mL無菌水，用無菌研缽研成勻漿。將青麥仁勻漿按比例10-3、10-4、10-5的稀釋梯度進行稀釋，用移液槍分別吸取1 mL懸液至各選擇性培養(yǎng)基中，用涂布器涂布均勻后，每個稀釋度重復(fù)3次，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，取適當(dāng)稀釋度的瓊脂平板計算菌落總數(shù)。

在培養(yǎng)基上選取典型菌落在相應(yīng)的選擇性培養(yǎng)基上反復(fù)劃線分離純化后進行培養(yǎng)，將純化好的單菌落制成15%甘油菌懸液，放入-80℃冰箱保存。

1.2.2.2 菌相基本形態(tài)特征

對分離純化后的單個細(xì)菌的菌落形態(tài)（包括菌落顏色、菌落形狀、菌落隆起度、菌落邊緣、菌落透明度、表面形態(tài)、質(zhì)地等）進行觀察、記錄[16]。

1.2.3 優(yōu)勢微生物的鑒定

1.2.3.1 生理生化試驗

參考東秀珠等[17]的方法對優(yōu)勢微生物進行生理生化鑒定。

1.2.3.2 16S rDNA序列測定

將優(yōu)勢菌株按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明提取細(xì)菌DNA，細(xì)菌擴增所用的引物為通用引物27f和 1492r(1)。上游引物 27f：5′-AGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3′，下游引物 1492(1)：5′-GGTTACCTTGT TACGACTT-3′。PCR擴增條件：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸45 s，共30個循環(huán)，72℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后送上海生工測序。將測序的拼接結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上利用Blast軟件在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行同源性分析。采用MEGA4.0軟件依據(jù)鄰位相鄰法對所有分離鑒定菌株的16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列進行分析比較，繪出系統(tǒng)進化樹。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件進行數(shù)據(jù)分析與制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 速凍青麥仁的菌相分析

在一種或一類食品中，內(nèi)在各種微生物之間相互競爭與拮抗、互利共生或偏利共生以適應(yīng)各自環(huán)境條件而共存于食品內(nèi)環(huán)境中，形成了特定微生物群體分布，稱為食品微生物菌相[18]。青麥仁由于含水量較成熟小麥高，凍藏過程中溫度波動易受微生物污染使其品質(zhì)降低，而導(dǎo)致谷物變質(zhì)的微生物主要是細(xì)菌和霉菌[19-20]。因此，本研究取貯藏于-20℃冰箱的青麥仁，分別采用PCA培養(yǎng)基、CFC培養(yǎng)基、改良MC培養(yǎng)基和孟加拉紅培養(yǎng)基分析速凍青麥仁中微生物菌群基本構(gòu)相。

通過對速凍青麥仁菌相分析（圖1）可知：在青麥仁凍藏期間，細(xì)菌為主要菌群，其中細(xì)菌總數(shù)為3.76 lg(CFU/g)。我國尚無對于速凍青麥仁的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，一般采用速凍面米制品的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[21]作為標(biāo)準(zhǔn)。GB 19295—2011[21]中規(guī)定，速凍面米制品的菌落總數(shù)不應(yīng)超過4lg(CFU/g)，因此，鮮食青麥仁可通過速凍的方式貯藏。霉菌酵母菌相對較少，為0.56 lg(CFU/g)。這些微生物即青麥仁凍藏過程中的初始菌相，是解凍后引起青麥仁發(fā)生腐敗的主要原因。

2.2 菌相基本形態(tài)特征

通過對速凍青麥仁中的微生物分離純化，將形態(tài)特征一致的歸為一種，共得到細(xì)菌28種，真菌3種。各菌株形態(tài)特征如表2、表3所示。

2.3 優(yōu)勢微生物鑒定

細(xì)菌和霉菌只要環(huán)境適宜時，就能迅速繁殖，使某些菌群占優(yōu)勢，構(gòu)成解凍后的青麥仁腐敗時特征性菌相，造成其腐敗變質(zhì)。由于青麥仁中霉菌數(shù)量較細(xì)菌少，故從細(xì)菌中選取速凍青麥仁的優(yōu)勢微生物。分別統(tǒng)計28株細(xì)菌的菌落總數(shù)，按數(shù)量及所占比例選擇前3株作為優(yōu)勢菌株進行鑒定，各菌株菌落總數(shù)如圖2所示。

通過對速凍青麥仁細(xì)菌菌落總數(shù)測定并結(jié)合基本形態(tài)觀察，選取3株優(yōu)勢微生物（QX-1、QX-4、QX-26）進行生理生化試驗和16S rDNA序列測定。

2.3.1 優(yōu)勢微生物的生理生化鑒定

上述生理生化試驗結(jié)果表明：QX-1、QX-26為革蘭氏陰性菌，QX-4為革蘭氏陽性菌。3株菌都為好氧菌，過氧化氫酶試驗陽性，在過低或者過高的溫度下都不適宜生長，在鹽濃度低時生長旺盛，鹽濃度過高時，菌株生長受到抑制。QX-1和QX-26能使明膠液化，QX-1和QX-4能使淀粉水解（表4）。

表4 優(yōu)勢微生物生理生化試驗結(jié)果Table 4 Results of conventional physiological and biochemical tests of dominant microorganisms

2.3.2 16S rDNA序列測定

將分離得到的3株優(yōu)勢菌QX-1、QX-4和QX-26進行16S rDNA測序鑒定。提取這3株優(yōu)勢菌的基因組DNA，并以此為模板擴增16S rDNA，經(jīng)電泳檢測（圖3），擴增的條帶長度約1 400 bp。將PCR產(chǎn)物測序結(jié)果在NCBI中進行比對，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）。

由圖4可知，所有序列與己知菌株的序列相似度均≥98%，說明鑒定結(jié)果可靠。經(jīng)分子生物學(xué)鑒定后3株菌株分別為：QX-1為鞘氨醇單胞菌屬、QX-4為微桿菌屬、QX-26為不動桿菌屬。

3 結(jié)論與討論

采用菌落計數(shù)法測定速凍青麥仁中的菌落總數(shù)，其中細(xì)菌總數(shù)為3.76 lg(CFU/g)。由于我國尚無對速凍青麥仁的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，故采用GB 19295—2011[21]速凍面米制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)為參考。標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定：速凍面米制品的菌落總數(shù)不應(yīng)超過4 lg(CFU/g)。由此可知，速凍是鮮食青麥仁最佳貯藏方式之一。

大部分微生物在速凍貯藏條件下其生長繁殖因溫度因素影響而受到抑制。微桿菌屬及不動桿菌屬菌株常見于冷凍食品中[22-24]，多為水產(chǎn)類及肉類，谷物類則少見報道。鄧佳等[25]發(fā)現(xiàn)，微桿菌屬為導(dǎo)致藍(lán)莓腐爛的病原細(xì)菌，故猜測其有可能是速凍青麥仁中優(yōu)勢腐敗菌之一，應(yīng)對其進行進一步的研究。傅曉方等[26]從玉米中分離到的不動桿菌具有固氮酶活性和產(chǎn)吲哚乙酸（IAA）、降解有機磷能力，且可促進小麥幼苗生長、降解玉米赤霉稀酮[27]。鞘氨醇單胞菌是一類豐富的新型微生物資源，可用于芳香化合物的生物降解[28]，該屬菌株憑借自身的高代謝能力與多功能的生理特性，在環(huán)境保護及工業(yè)生產(chǎn)方面具有巨大的應(yīng)用潛力。孫建光等[29]在玉米及芹菜中發(fā)現(xiàn)內(nèi)生鞘氨醇單胞菌，而本試驗中分離到的鞘氨醇單胞菌是青麥仁本身所具有的還是由于外界因素影響攜帶的尚有待進一步驗證，其應(yīng)用潛力也值得進一步開發(fā)利用。

本試驗對凍藏期內(nèi)青麥仁菌相進行分析可知，其細(xì)菌菌落總數(shù)為3.76 lg(CFU/g)。經(jīng)分離純化后得到特異性細(xì)菌28株，真菌3株，菌落基本形態(tài)觀察及菌落總數(shù)計數(shù)得到速凍青麥仁中優(yōu)勢菌群3株，經(jīng)生理生化鑒定及16S rDNA序列測定可知速凍青麥仁中的3株優(yōu)勢菌分別為：QX-1鞘氨醇單胞菌屬、QX-4微桿菌屬和QX-26不動桿菌屬。