傳統山西老陳醋增香酵母菌的篩選及其特性研究

陳 嘉，馮志宏，施俊鳳

（山西省農業科學院農產品貯藏保鮮研究所，山西 太原 030031）

山西老陳醋以“蒸、酵、熏、淋、陳”五步工藝傳承至今[1]，是我國國家地理標志性產品，具有鮮明的地方特色。傳統食醋發酵過程主要分為酒化和醋化階段，食醋的風味物質大部分是在酒化過程中形成帶入產品的[2-3]，這些風味物質主要通過大曲中的菌系、酶系產生[4]。酒化中酯類和醇類物質主要由酵母代謝合成[5]。酒化階段主要的酵母菌有釀酒酵母、畢赤酵母、漢遜酵母、球擬酵母、假絲酵母等[6]。在傳統山西老陳醋釀造過程中，微生物的生長受到各種因素的影響[7]，如菌種組成、發酵溫度、酒度、酸度等，它們直接影響產品的風味[8]、色澤[9]、品質。我國傳統發酵制品中廣泛存在著優良的自然菌株，可作為分離篩選優良野生菌株的重要來源[10]。根據傳統釀造食品生產的需求，針對不同產品發酵特點進行優良菌種的選育并建立相適應的發酵技術規范，對于促進我國傳統釀造調味食品現代化，提高產品市場競爭力具有重要的意義。

本試驗從傳統山西老陳醋中分離純化酵母菌菌株，通過26S rDNA測序鑒定。采用頂空固相微萃取（HS-SPME）法結合氣-質聯用技術（GC-MS）對分離得到的酵母菌發酵液中的主要揮發性成分進行分析[11]，篩選出產醇香或酯香的酵母菌菌株，對其耐酸性、乙醇耐受性和高溫耐受性進行研究，旨在為山西老陳醋用酵母菌菌株的研究開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

醋醅樣品：于2017年12月采集自山西紫林醋業有限公司山西老陳醋傳統工藝生產車間。

酵母基因組DNA提取試劑盒、2×Es Taq Master Mix（含染料），購自北京康為世紀生物科技有限公司；孟加拉紅選擇培養基、麥芽汁培養基、酵母浸出粉胨葡萄糖（YEPD）培養基，購自海博生物技術有限公司；安琪活性干酵母，購自安琪酵母（伊犁）有限公司；乙醇、NaCl、乙酸，購自國藥集團化學試劑有限公司；美藍試劑，購自上海經科化學科技有限公司。

1.1.2 儀器與設備

MLS-3020型全自動高壓滅菌器，T100TMThermal Cycler PCR儀，Centrifuge 5415R高速冷凍離心機，ZHWY-103B型恒溫培養振蕩器，SPX-100B-Z型生化培養箱，OLYMPUS CX21型顯微鏡，BS224S型電子天平，自動SPME進樣器，DB-Wax型毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），TRACE-ISQ 氣相色譜-質譜聯用儀，20 mL進樣瓶，65 μm聚二甲基硅氧烷/聚二乙烯基苯（PDMS/DVB）纖維萃取頭。

1.2 方法

1.2.1 酵母菌的分離純化

準確稱取10 g醋醅樣品置于90 mL生理鹽水中，28 ℃振蕩培養 30 min，依次稀釋至 10-5、10-6，取100 μL稀釋液涂布于孟加拉紅培養基，28℃培養48 h。挑取具有典型酵母菌落特征的單菌落，劃線分離純化[12]。將具有酵母細胞特征的菌株轉入YEPD斜面培養基，4℃保存，備用。酵母菌活化后接種到YEPD瓊脂培養基上，28℃恒溫培養48 h，觀察菌落形態；載玻片上滴加1滴0.05%美藍試劑與少量菌體混勻，加蓋玻片，顯微鏡下觀察細胞形態。

1.2.2 菌株26S rDNA分子鑒定

根據酵母基因組DNA提取試劑盒操作說明提取酵母基因組DNA，核酸蛋白測定儀ND-1000測定DNA純度、濃度，-80℃保存[13]。參考GenBank上已登錄的代表菌株26S rDNA近5’端的D1/D2區域序列（登錄號：KC442921.1），設計1對特異性引物，引物序列為（5’-3’）：NL-1(GCATATCAATAAGC GGAGGAAAAG)和NL-4(GGTCCGTGT TTCAAGACGG)。以不同酵母基因組DNA為模板，構建15 μL PCR反應體系[14]：正反向引物（10 μmol·L-1）各 0.6 μL，基因組 DNA 模板0.8 μL，ddH2O 5.5 μL，2 × Es Taq Master Mix 7.5 μL。反應條件：94℃3 min；94 ℃30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃30 s，35個循環；72℃5 min，產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，交由北京華大中生科技發展有限公司測序，測序結果進行Blast比對。

1.2.3 發酵液中揮發性風味物質的測定

接一環斜面菌種于5 mL麥芽汁液體培養基中，30℃振蕩培養1 d，按20%（V/V）接種于山西老陳醋物料中，發酵釀醋，澄清過濾，4℃、10 000 r/min離心10 min，收集上清液，4℃保存備用。吸取8 mL上清液置于20 mL的分析瓶中，加入0.6 g NaCl加蓋封口。采用頂空自動進樣法[15]：①頂空進樣器條件：振蕩溫度45℃，振蕩時間2 min，進樣量2 mL。②氣相色譜（GC）分析條件：色譜柱為 TR-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進樣口溫度 300℃，載氣 He，流速 1 mL/min；進樣量 350 μL，分流比為 20∶1；升溫程序：起始溫度40℃，保持3 min，以3℃/min的速度升溫至190℃，保持5 min，以20℃/min的速度升溫至270℃，保持5 min；③質譜（MS）條件：電子轟擊（EI）離子源，電子能量70 eV，離子源溫度250℃，傳輸線溫度280℃，四極桿溫度180℃，質量掃描范圍（m/z）：35~500。

1.2.4 酵母菌耐酸性

將活化后的酵母菌懸液按3%的接種量接種于pH 分別為 2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 的 YEPD 液體培養基中，28℃振蕩培養72 h，將培養液4 000 r/min離心10 min，棄上清，稱量菌體濕重。

1.2.5 酵母菌的乙醇耐受性

將活化后的酵母菌懸液按3%的接種量接種于乙醇濃度分別為6%、8%、10%、12%的YEPD液體培養基中，28℃搖床培養72 h，將培養液4 000 r/min離心10 min，棄上清，稱量菌體濕重。

1.2.6 酵母菌高溫耐受性

按3%的接種量接種活化后的酵母菌于YEPD液體培養基中，分別置于 30、35、40、45、50 ℃條件下培養72 h，將培養液4 000 r/min離心10 min，棄上清，稱量菌體濕重[16]。

1.2.7 數據處理

采用SPSS Statistics 24軟件分析數據并作圖。

2 結果與分析

2.1 酵母菌菌株的篩選與鑒定

從傳統山西老陳醋的發酵過程中進行酵母菌菌株的篩選。通過菌種形態觀察以及利用顯微鏡觀察其細胞形態和菌絲形態，初步獲得了5株菌株，有待進一步鑒定。

提取該5株菌株的基因組DNA進行PCR擴增，以市售安琪活性干酵母為對照（CK），擴增產物瓊脂糖凝膠電泳結果如圖1所示。

由圖1可見，共擴增出6條特異條帶。回收擴增產物，測序，Blast序列同源性比對，結果見表1。Blast結果顯示，菌株Y1為釀酒酵母，Y26為畢赤酵母，Y30為假絲酵母，Y68為紅酵母，Y70為盔形畢赤酵母。

表1 不同菌株26S rDNA鑒定結果Table 1 Identification of different strains by 26S rDNA

2.2 增香酵母發酵液揮發性風味成分分析

傳統山西老陳醋發酵工藝中，微生物發酵產生揮發性成分，風味物質主要為醇類和酯類。利用HS-SPME-GC-MS法分析6種酵母菌發酵液中的揮發性成分，空白組為不添加酵母發酵液，結果見表2。由表2可知，不同酵母菌發酵液中，揮發性成分種類和數量之間差異較大。Y1發酵液中醇類揮發性物質相對峰面積最大，為52.31%，占其總揮發性物質一半以上。6種發酵液中均有酯類揮發性物質產生，且Y1、Y26、Y30、Y68 和 Y70 發酵液中揮發性酯類峰面積均比對照組中多；Y70發酵液中酯類物質相對峰面積最大，為37.76%，其中乙酯類為30%，占總酯類物質79.45%。Y26和Y70發酵液中均有己酸異戊酯和乳酸乙酯產生；其中乳酸乙酯帶有發酵香氣，是構成山西老陳醋香氣的重要組成成分。

2.3 增香酵母的發酵特性試驗

2.3.1 耐酸性

傳統山西老陳醋發酵工藝又稱為“三邊”發酵，即邊糖化、邊酒化、邊醋化。整個發酵進程中，酵母菌通常與醋酸菌、乳酸菌同時作用，因此酵母菌必須適應產酸菌造成的酸性環境并能良好生長。發酵過程中，有機酸不斷形成和累積，pH范圍為3.6~3.9。適宜于

山西老陳醋的酵母菌必須有良好的耐酸性，一般要求能耐受pH 3～3.5。由圖2可以看出，Y30和Y26在pH 3～3.5發酵液中生長良好，具有一定耐酸性。

表2 發酵液中醇類、酯類成分的GC-MS 分析結果Table 2 Determination of alcohols and esters in fermentation broth by GC-MS

2.3.2 乙醇耐受性

傳統山西老陳醋固態發酵過程中，隨著發酵液中乙醇濃度的增加，酵母菌受到的乙醇脅迫越來越大。山西老陳醋發酵過程中乙醇最高濃度達10%，高濃度乙醇影響酵母菌的生長和發酵能力，進而限制產物濃度的提高，因此所用酵母應具有較好的乙醇耐受性，一般要求菌種至少能耐受10%的乙醇。由圖3可以看出，Y26在10%乙醇發酵液中生長良好，具有較好的乙醇耐受性。

2.3.3 高溫耐受性

傳統山西老陳醋固態發酵過程中，酵母菌與醋酸菌共存并同時代謝，醋酸菌有氧呼吸釋放大量的熱，導致物料溫度最高上升到42～45℃。傳統酵母發酵最適溫度為28～33℃，溫度變化導致微生物生長和繁殖速度改變以及微生物酶活性的變化，進而影響產品品質和產量。因此酵母菌須適應高溫環境并良好生長。由圖4可以看出，隨著發酵液溫度的升高，菌株生長均受到抑制，各菌株間差異不顯著。

3 結論

從傳統山西老陳醋中分離篩選得到5株酵母菌，經鑒定Y1為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），Y26為畢赤酵母（Pichia scaptomyzae），Y30為假絲酵母（Candida humilis），Y68 為紅酵母（Rhodotorula sp.），Y70為盔形畢赤酵母（Pichia membranifaciens）。經固相微萃取和氣質聯用技術分析這5株酵母菌發酵液的主要揮發性醇類和酯類物質發現，揮發性成分種類和數量之間差異較大，其中釀酒酵母Y1發酵液中醇類揮發性成分最多，但種類少于畢赤酵母Y26和紅酵母Y68。這5株酵母菌醇類揮發性物質中，均含有乙醇、苯乙醇、2-乙基己醇和糠醇，它們具有強烈的香味。畢赤酵母Y26和盔形畢赤酵母Y70發酵液中酯類揮發性成分含量較高，對風味的貢獻相對較大，醋酸乙酯含量較高。

5株酵母菌發酵特性研究結果表明，假絲酵母Y30具有優良的耐酸性，在pH 3～3.5時仍生長良好，推測是1株嗜酸酵母菌；畢赤酵母Y26具有優良的乙醇耐受性，且具有高產乙酯類、低產高級醇的特性。綜合比較，畢赤酵母Y26有望開發為山西老陳醋的新型發酵劑。