乳酸菌發酵香菇柄產γ-氨基丁酸培養基的優化

劉麗娜，王安建，李順峰，田廣瑞，魏書信，高帥平

（河南省農業科學院農副產品加工研究中心，河南 鄭州 450002）

香菇（Lentinus edodes）是我國特產食用菌，不僅味道鮮美、營養豐富，而且具有獨特的香氣，深受人們的喜愛[1]。2016年，我國香菇產量達898萬t，居我國六大主要食用菌品種之首。香菇柄是香菇商品化處理的廢棄物，占整個子實體質量的15%～30%。由于菇柄呈纖維化，適口性差，少量用作飼料，絕大部分都被廢棄，全國每年廢棄的香菇柄有數萬噸，造成了極大的資源浪費。實際上香菇柄和菇蓋同樣是由香菇菌絲組成，含有豐富的蛋白質、糖類、維生素、礦物元素、膳食纖維等營養成分，其中谷氨酸在其蛋白質組成和游離氨基酸中均是含量最高的[2]，而谷氨酸在谷氨酸脫羧酶（Glutamic acid decarboxylase，GAD）脫羧作用下可生成γ-氨基丁酸（GABA），它是一種功能性氨基酸。因此，香菇柄可作為開發功能食品的潛在基料。

在γ-氨基丁酸的食品開發中，采用生物技術方法獲得的GABA制品具有廣闊前景。除了傳統的茶和米胚芽類制品外，米糠[3]、糙米[4]、乳制品類[5-6]等也被研究通過生物技術強化GABA含量，進而提高其附加值。目前已在大腸桿菌、乳酸菌、酵母菌、曲霉等微生物中發現谷氨酸脫羧酶的存在，其中用乳酸菌生產GABA是被公認為安全、綠色天然的方法。很多乳酸菌都具有產GABA的能力，但在GABA生產上研究最多的乳酸菌是短乳桿菌、乳酸乳球菌、類干酪乳桿菌等[7]。

培養基優化是提高發酵產物產量的有效途徑之一，培養基成分會影響乳酸菌合成GABA[8]。周青等[9]優化了Lactobacillus plantarumWZ011的發酵培養基，GABA產量達到5.814 g/L，比優化前提高了79%。孟和畢力格等[10]對Lactobacillus lacticWH11-1的發酵培養基進行了優化，采用優化后的培養基，發酵液中GABA含量達到了10.78 g/L。Park等[11]利用Lactobacillus brevisOPY-1發酵脫脂牛乳產GABA時，向培養基中添加大豆提取物，結果發現GABA產量從1.5 μg/g提高到424.67 μg/g。基于文獻報道與分析，本研究從拓展香菇柄廢棄物深加工綜合利用的角度出發，采用低成本的香菇柄為培養基料，利用乳酸菌發酵產GABA，以期為新型富含GABA的功能性香菇制品的開發提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

香菇柄原料，購自農貿市場，烘干后粉碎過40目篩，取篩下物密封保存備用。

植物乳桿菌植物亞種（Lactobacillus plantarumsubsp.plantarum，GIM1.380），購自廣東省微生物菌種保藏中心；MRS肉湯培養基，購自廣東省環凱生物科技有限公司；GABA標準品，美國Sigma-Aldrich公司產品；甲醇、乙腈、乙酸鈉、冰醋酸、氯甲酰芴甲酯（FMOC-Cl）均為色譜純；四氫呋喃、谷氨酸、硼酸、硼砂、谷氨酸鈉、乙醇、重蒸酚、次氯酸鈉、葡萄糖、磷酸吡哆醛（PLP）、氯化鈣等均為分析純。

1.1.2 儀器與設備

FA2004C型分析天平，THZ-98AB型恒溫振蕩器，XM120-HR型快速水分測定儀，MJ-78A型高壓滅菌鍋，VS-840K-U型超凈工作臺，DF-10型恒溫磁力攪拌器，GZX-9240MBE型電熱鼓風干燥箱，UV-1800型紫外可見分光光度計，LD-Y300A型高速萬能粉碎機，Advanced-I型艾柯超純水機，FE20型pH計，H2050R型臺式高速冷凍離心機，Dionex Ultimate 3000型高效液相色譜儀。

1.2 方法

1.2.1 發酵劑的制備

將植物乳桿菌植物亞種GIM1.380菌種接種在滅過菌的MRS肉湯培養基中，接種量2%，培養溫度為37℃，150 r/min振蕩培養16~20 h為活化一次，共活化培養3次，即得到發酵劑[12]。

1.2.2 乳酸菌發酵香菇柄產GABA發酵試驗

將香菇柄粉與去離子水按料液比1∶20（g/mL）混勻后作為基礎發酵培養基，滅菌冷卻至室溫，接入4%發酵劑，發酵溫度37℃條件下，150 r/min振蕩培養發酵60 h，發酵結束后測定生成GABA的產量[13]。

1.2.2.1 發酵培養基成分的確定

在基礎發酵培養基（香菇柄粉與去離子水按料液比1∶20(g/mL)混勻）中分別加入不同含量谷氨酸鈉（2、4、6、8、10、12 g/L）、不同含量氯化鈣（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L）、不同含量 PLP（0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 g/L），研究其對GABA產量的影響。

1.2.2.2 發酵培養基組成的優化

選擇谷氨酸鈉、氯化鈣、PLP三個因素，在單因素試驗基礎上進行L9(34)正交試驗，以GABA產量為評價指標，確定發酵培養基的最優組成。正交試驗因素與水平設計見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment單位：g/L

1.2.3 HPLC法測定GABA

1.2.3.1 色譜條件[14]

ZORBAXEclipsePlusC18色譜柱（4.6mm×250mm，5 μm）；流速 1 mL/min；柱溫度：40 ℃；進樣體積：20 μL；采用二極管陣列紫外檢測器PDA-3000，檢測波長：265 nm；流動相：A為50 mmol/L乙酸鈉溶液（pH 4.8）-甲醇-乙腈-四氫呋喃（82∶8.5∶8.5∶1，V/V），B為50 mmol/L乙酸鈉溶液（pH 4.8）-甲醇-乙腈-四氫呋喃（22∶38.5∶38.5∶1，V/V），A-B 為體積比 30∶70 等度洗脫。

1.2.3.2 衍生程序

取80 μL標準溶液或樣品于1.5 mL離心管中，依次加入 180 μL 超純水、160 μL 0.1mol/L 硼酸-硼砂緩沖液（pH 8.6）、240 μL 乙腈和 160 μL 4mmol/L FMOC-Cl溶液，混合均勻，在40℃水浴鍋中反應5 min，經0.22 μm微孔濾膜過濾后備用。其中衍生試劑4 mmol/L FMOC-Cl溶液配制方法為：稱量0.026 g FMOC-Cl溶于25 mL乙腈中。

1.2.4 數據處理

數據統計與處理采用Origin 8.6和SPSS 22.0軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 HPLC測定香菇柄發酵液中GABA的分析

以FMOC-Cl為柱前衍生劑，采用高效液相色譜法對發酵液中的GABA進行檢測。圖1~3分別表示標準品、衍生劑、香菇柄發酵液色譜圖。通過對比可以看出，GABA與衍生劑色譜圖峰形好，得到了很好地分離，GABA出峰的保留時間是5.93 min左右，香菇柄發酵液中其他氨基酸或干擾物對GABA的測定均無影響，說明本法檢測GABA能夠滿足試驗分析要求。取不同濃度的標準液，衍生后測定GABA，以峰面積為縱坐標，標準品濃度為橫坐標，建立標準曲線，擬合得到回歸方程為：Y=0.380 5X+0.414 5（R2=0.999 4），GABA濃度在10~1 000 mg/L時線性關系良好，能用于發酵液中GABA的定量分析。

2.2 發酵培養基成分的確定

2.2.1 谷氨酸鈉添加量對發酵液GABA產量的影響

在發酵過程中，谷氨酸鈉是谷氨酸脫羧酶催化酶促反應生成GABA的底物，發酵時谷氨酸鈉的添加量會直接影響GABA的產量[15]。如圖4所示，在基礎培養基中添加谷氨酸鈉能顯著提高GABA產量（P＜0.05），隨著谷氨酸鈉添加量的增加，GABA產量逐漸增大，當谷氨酸鈉添加量達到8 g/L時，GABA產量達到最大，之后繼續增加谷氨酸鈉添加量，GABA產量反而減小。說明試驗菌種利用底物谷氨酸鈉進行生物轉化GABA的能力是有限的，過量添加反而不利于GABA的積累，這可能是因為底物濃度過高會增強細胞膜的滲透壓力，抑制菌體生長，從而導致GABA產量減少[16]。

2.2.2 氯化鈣添加量對發酵液GABA產量的影響

谷氨酸脫羧酶是生物技術富集生產GABA的關鍵酶，有許多資料報道鈣離子對谷氨酸脫羧酶有促進作用[17-19]。本試驗在其他發酵條件一致的情況下，向基礎培養基中添加了不同含量的氯化鈣。試驗發現（圖5）：當氯化鈣添加量低于0.2 g/L時，發酵液中GABA產量逐漸增加；氯化鈣添加量為0.2 g/L時，GABA產量最高，與添加量為0.3 g/L之間無顯著性差異；繼續提高添加量，GABA產量顯著降低（P＜0.05）。這說明一定范圍內添加氯化鈣能明顯提高發酵液中GABA產量，添加量過高時會因抑制谷氨酸脫羧酶的活性反而使GABA產量降低，這與同仲彬等[20]和Guo等[21]的研究結果一致。

2.2.3 PLP添加量對發酵液GABA產量的影響

PLP是多種脫羧酶的輔酶，能增強脫羧酶活性，促進酶促反應，其添加量會直接影響谷氨酸脫羧酶的活性，進而影響GABA產量[22-23]。由圖6可知，培養基中添加PLP后，發酵液中GABA產量呈現先升高再降低后趨于平緩的趨勢；PLP添加量小于0.2 g/L時，GABA產量隨PLP的增加而顯著增加（P＜0.05），添加量達到0.2 g/L時，GABA產量最高，為130.50 mg/L。說明PLP對試驗菌種的谷氨酸脫羧酶具有一定的促進作用，谷氨酸脫羧酶活性增強，利于GABA的生成。同時，由于PLP也是GABA-轉氨酶的輔酶，當其濃度足夠高時，就會促進催化GABA降解成琥珀酸半醛，使GABA產量降低[24-25]。

2.3 發酵培養基組成的優化

根據單因素試驗結果，對谷氨酸鈉、氯化鈣、PLP添加量進行四因素三水平正交試驗，試驗結果與分析見表2，方差分析見表3。

表2 正交試驗結果Table 2 Results of orthogonal experiment

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

根據表2的結果，經極差分析可知，3個因素對GABA產量的影響從大到小的順序為：A＞C＞B，即谷氨酸鈉添加量影響最大，其次是PLP添加量，氯化鈣添加量的影響最小。發酵培養基組成的最優組合為A2B3C2，即谷氨酸鈉添加量為8 g/L，氯化鈣添加量為0.3 g/L，PLP添加量為0.2 g/L。經驗證試驗得出，該最優組合的GABA產量為190.93 mg/L。由表3方差分析可知，谷氨酸鈉添加量（A）和PLP添加量（C）對GABA產量影響顯著（P＜0.05），而氯化鈣添加量（B）對GABA產量的影響相對較小。

2.4 香菇柄發酵前后GABA含量的比較

香菇柄發酵前后GABA含量的HPLC分析結果見圖7。

對比香菇柄發酵前后GABA含量的離子色譜圖，根據面積歸一化法計算出發酵前后GABA的含量，結果見表4。經過發酵后，發酵液中GABA產量由31.82 mg/L提高至190.93 mg/L，未經過發酵處理的香菇柄中GABA含量是0.493 mg/g菇粉，采用優化后發酵工藝進行發酵后的香菇柄中GABA含量增加到2.959 mg/g菇粉，比香菇柄原料提高了5倍，說明利用乳酸菌發酵香菇柄可以富集GABA。

表4 香菇柄發酵前后GABA含量的比較Table 4 Comparison of GABA content in Lentinus edodes stem before or after fermentation

3 結論

本研究采用FMOC-Cl衍生HPLC法定量分析GABA，通過單因素試驗和正交試驗對乳酸菌發酵香菇柄的培養基成分進行優化，確定了最佳發酵培養基成分為：谷氨酸鈉添加量8 g/L，氯化鈣添加量0.3 g/L，PLP添加量0.2 g/L。在此條件下，發酵液中GABA產量可達190.93 mg/L，發酵香菇柄中GABA含量達到2.959 mg/g菇粉，比未經發酵處理的香菇柄原料提高了5倍。發酵菌種、發酵原料對GABA含量具有很大的影響。本文研究結果表明，基于乳酸菌進行富含GABA和乳酸菌功能性香菇柄食品的研究和開發是可行的，是拓展香菇柄的精深加工、增強其功能性的一條新途徑，但試驗菌種產GABA的代謝途徑及發酵后香菇柄的抗菌功能還有待于進一步的研究。