腎病及相關(guān)疾病患兒EB病毒DNA檢測分析*

江楊華 宋 然 李 艷 林應(yīng)標

湖南省郴州市第一人民醫(yī)院 1 檢驗醫(yī)學中心 2 血管外科 423000

EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)是皰疹病毒的一種，在人群的感染非常普遍，在各個年齡階段均存在不同程度的感染，且年齡不同，引起的疾病譜差異較大。中老年人，EBV引起的惡性淋巴組織增生性疾病發(fā)病率高，包括預(yù)后不佳的慢性活動性EBV感染、惡性淋巴組織增生性疾病及腫瘤[1]等；青少年感染EBV后，大部分表現(xiàn)為傳染性單核細胞增多癥，少部分可異位感染T淋巴細胞、上皮細胞及NK細胞等[2]，也可引起慢性EBV感染，干擾免疫功能，導(dǎo)致細胞免疫功能紊亂；EBV的原發(fā)感染多發(fā)生在兒童期，臨床上可表現(xiàn)為無明顯癥狀、傳染性單核細胞增多癥或引起非典型EBV感染，累及全身各個系統(tǒng)(呼吸道感染性疾病、消化系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病、泌尿系統(tǒng)疾病等)，癥狀多樣，程度輕重不一[3-4]。

兒童腎病及相關(guān)疾病的病因復(fù)雜，影響因素較多，往往是多種因素共同作用的結(jié)果。由于EBV感染的隱蔽性(癥狀不明顯)，在缺乏經(jīng)典臨床特征的情況下，醫(yī)生最初往往不會考慮EBV感染，使得診斷出現(xiàn)偏差和治療效果欠佳。為了解EBV與腎病及相關(guān)疾病的關(guān)系及對疾病進展的影響，本研究回顧性地分析了該類患者EBV感染及病毒DNA載量水平情況。

1 對象與方法

1.1 研究對象及樣本采集 收集2018年7月—2019年6月期間在我院兒童腎內(nèi)科住院患兒435例為測試組，其中男288例，女147例，年齡9個月～14歲。按照小兒腎病診斷標準[5-7]，可分為101例腎病綜合征患兒，102例急性腎小球腎炎患兒和232例過敏性紫癜患兒，排除血液病和免疫缺陷病小兒。同時收集同一時期本院正常體檢兒童103例，男62例，女41例，年齡10個月～14歲，作為對照組。所有兒童用EDTA-K2抗凝管采集靜脈血2ml。

1.2 儀器與試劑 EBV DNA的檢測儀器采用美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司的ABI7500熒光定量PCR儀，試劑采用湖南圣湘生物科技有限公司的EBV核酸熒光定量檢測試劑盒。

1.3 EBV-DNA抽提 嚴格按照試劑說明書分離外周血單個核細胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC)。過程如下：先取0.8ml全血樣本進行PBMC的分離，再將分離到的PBMC的數(shù)量調(diào)整至終濃度為1×105個/ml，稍離心后加入400μl核酸釋放劑充分混勻，75℃恒溫處理10min后，瞬時離心作為PCR擴增模板備用。

1.4 檢測方法 EBV-DNA的檢測采用實時熒光定量PCR方法進行，PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照試劑說明書。載量≥100copies/ml以上者，定為陽性，反之定為陰性。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。EBV-DNA載量呈非正態(tài)分布，用中位數(shù)表示，組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗，EBV-DNA陽性率之間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 腎病及相關(guān)疾病患兒EBV感染情況 腎臟及相關(guān)疾病患兒EBV感染情況如表1所示：測試組的總陽性率為53.56%，明顯高于對照組的26.21%(χ2=24.946，P=0.000)，測試組EBV陽性患者病毒載量明顯高于對照組(Z=-2.725,P=0.006)；而測試組男女之間EBV的陽性率和病毒載量差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 腎病及相關(guān)疾病患兒EBV感染情況比較

注：男女陽性率差異比較：χ2=0.211，P=0.646；男女陽性者EBV-DNA載量差異比較：Z=-0.33，P=0.974；測試組和對照組陽性率差異比較：χ2=24.946，P=0.000；測試組和對照組陽性者EBV-DNA載量差異比較：Z=-2.725,P=0.006。

2.2 不同腎病及相關(guān)疾病的EBV感染情況 不同腎臟及相關(guān)疾病中EBV陽性率及病毒載量如表2所示：不同疾病組之間，EBV的陽性率存在明顯差異(P<0.05)，其中急性腎小球腎炎組的EBV的陽性率最高，顯著高于過敏性紫癜組和腎病綜合征組；過敏性紫癜組次之，顯著高于腎病綜合征組。而不同疾病之間EBV陽性者的病毒載量則差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表2 不同腎病及相關(guān)疾病患兒EBV感染情況

注：兩兩之間差異比較：①陽性率：腎病綜合征與急性腎小球腎炎χ2=21.011，P=0.000，腎病綜合征與過敏性紫癜χ2=4.141，P=0.042，急性腎小球腎炎與過敏性紫癜χ2=11.438，P=0.001。②陽性者EBV-DNA載量各組間沒有差異。

3 討論

兒童非典型性原發(fā)EBV感染臨床表現(xiàn)多樣，幾乎可累及任何器官，腎臟是EBV感染后常累及的器官之一[5]，EBV可直接或間接參與腎損傷過程。目前有關(guān)EBV感染直接引起腎損傷的報道較少：1995年，Douglas L等[6]研究證實1例19個月齡兒童由于感染了EBV而發(fā)展為腎病綜合征，并且疾病的嚴重程度與EBV含量密切相關(guān)；1999年，Joanne LB等[7]發(fā)現(xiàn)EBV的受體CD21抗原同樣存在于腎近端小管細胞，且如該組織發(fā)生EBV感染CD21抗原表達會顯著上調(diào)，提示EBV感染在原發(fā)性間質(zhì)性腎炎炎癥和損傷模式的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用。EBV感染間接引起腎損傷的報道稍多：2010年，Mirna SD等[8]報道1例11歲男孩由于鏈球菌和EBV合并感染并同時參與了腎損傷，最后引起急性腎小球腎炎的病例；2017年，Burcu K等[9]報道了1例由于發(fā)生EBV原發(fā)性感染而引起過敏性紫癜的患者，而后并發(fā)腎病。這些都是個例報道，不具有廣泛代表性，而本研究發(fā)現(xiàn)，腎臟及相關(guān)疾病患兒血中EBV陽性率高達50%以上，陽性率和病毒載量均明顯高于正常對照組，這表明腎相關(guān)疾病患兒確實普遍存在EBV感染，且與性別無關(guān)。近年來，隨著研究的深入，EBV感染與腎損傷之間關(guān)系的報道也逐漸增多，在臨床中越來越引起重視。

本研究針對不同患者進行分析發(fā)現(xiàn)，不同腎相關(guān)疾病患兒EBV陽性率明顯不同，其中急性腎小球腎炎患兒EBV陽性率最高，過敏性紫癜次之，腎病綜合征最低；但EBV陽性者的病毒載量在不同組之間沒有差異，這在查閱的文獻中暫未發(fā)現(xiàn)相似報道。其中的原因，我們推測：EBV感染一般發(fā)生于免疫力低下患兒，在腎相關(guān)疾病患兒中同樣如此；且EBV在腎相關(guān)疾病患兒的感染和致病不是孤立存在，常常與其他病原體協(xié)同起作用，加快或加重病程。急性腎小球腎炎和過敏性紫癜均與病原微生物感染有關(guān)，感染后患兒免疫力受損，甚至發(fā)生免疫紊亂，腎病綜合征患兒的免疫力更是長期受損，這都增大了EBV感染或再次激活復(fù)發(fā)的概率，從而影響疾病進展。

本研究還發(fā)現(xiàn)，有一些病情反復(fù)發(fā)作的患兒，如腎病綜合征，EBV感染存在多次被檢測出陽性的現(xiàn)象，這說明患兒EBV感染后，EBV會在體內(nèi)很長一段時間一直存在，很難徹底清除，但含量會有所波動，免疫力增強時病毒含量會下降，免疫力下降時，病毒含量又會上升，或是由于腎病患兒抵抗力相對較差，反過來又增加了EBV再次感染的概率。這種復(fù)雜的情況干擾了醫(yī)生的判斷，增加了臨床診斷的難度。

總之，兒童非典型性原發(fā)EBV感染在腎相關(guān)疾病中普遍存在，且在疾病進展中起著一定的作用；EBV常常伴隨著其他病原體一并感染，且病毒感染機體后在免疫低下的患者血中會長期存在。因此，為了提高腎相關(guān)疾病診斷的及時性和準確性，應(yīng)將EBV-DNA作為一種常規(guī)項目進行檢測，考慮病因時應(yīng)將EBV感染和其他因素一起綜合分析。