微泡濃度聯(lián)合脾臟硬度對(duì)初診AML患者預(yù)后評(píng)估的價(jià)值

王寧方，何文艷,趙崇山，尤月明，周志偉，王毅軍

河北中石油中心醫(yī)院，河北廊坊 065000

急性髓系白血病(AML)是起源于造血干祖細(xì)胞的克隆性惡性血液病，近年來(lái)，隨著新藥的使用及造血干細(xì)胞移植的開(kāi)展，完全緩解率(CR)顯著升高，但仍有50%～70%的患者最終復(fù)發(fā)，5年生存率僅為20%[1]。研究發(fā)現(xiàn)，高危染色體核型、FLT3突變是影響生存的危險(xiǎn)因素[2]。微泡(MPs)是從細(xì)胞表面脫落的直徑<1 μm的顆粒，通過(guò)將MPs成分(包括細(xì)胞膜蛋白、有活性的脂類(lèi)和mRNA)和感染性顆粒轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞，從而激活靶細(xì)胞，微粒有促凝、促血管生成、參與癌癥增殖和轉(zhuǎn)移、誘發(fā)耐藥等作用,并可預(yù)測(cè)預(yù)后[3]。研究發(fā)現(xiàn)，血漿組織因子來(lái)源微粒與急性早幼粒細(xì)胞白血病患者凝血異常密切相關(guān)[4]。FibroScan(FS)檢測(cè)脾臟硬度(SSM)已被廣泛用于肝病領(lǐng)域[5]，并用來(lái)評(píng)估骨髓纖維化患者抗JAK2治療效果[6]。目前尚鮮見(jiàn)AML患者M(jìn)Ps、SSM檢測(cè)及二者與AML患者預(yù)后相關(guān)性的報(bào)道。2016年1月～2019年7月,我們對(duì)43例初診AML患者進(jìn)行了MPs及SSM檢測(cè)，并分析其在患者預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2016年1月～2019年7月于我院就診的初治AML患者43例(AML組)，男20例、女23例，年齡35～80歲，中位年齡62歲，其中M0 2例，M1 8例，M2 9例，M3 7例，M4 10例，M5 7例。t(8；21)9例，t(15；17)7例，t(16；16)1例，正常核型11例，+8 1例，t(3，3)、-5、-7、t(6，9)、5q-、7q-各1例，復(fù)雜核型8例。FLT3突變陽(yáng)性16例。所有患者經(jīng)骨髓細(xì)胞學(xué)、免疫分型、細(xì)胞遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、骨髓病理等確診為AML。診斷標(biāo)準(zhǔn)參考WHO2016版標(biāo)準(zhǔn)。復(fù)發(fā)標(biāo)準(zhǔn)：完全緩解后外周血重新出現(xiàn)白血病細(xì)胞或骨髓原始細(xì)胞﹥0.05或髓外出現(xiàn)白血病細(xì)胞浸潤(rùn)。無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間(EFS)：獲得CR患者從CR之日至復(fù)發(fā)或者CR狀態(tài)下死亡的時(shí)間。總生存時(shí)間(OS)：從診斷之日至死亡或末次隨訪的時(shí)間。隨訪截止日期為2019年7月15日。排除標(biāo)準(zhǔn)：不能控制的癲癇患者，有嚴(yán)重未控制的精神疾病患者。另收集20例健康志愿者作為對(duì)照組，男10例、女10例，年齡25～60歲,中位年齡50歲。患者和志愿者均簽署知情同意書(shū)。本研究已通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 MPs濃度測(cè)定 采集AML患者(入院第1天)及健康志愿者(體檢日)4 mL EDTA抗凝的外周血，為避免污染，將前2 mL丟棄。標(biāo)本在采集后的1 h內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室處理。取2 mL外周血，2-16型水平離心機(jī)(美國(guó) Sigma 公司)2 000×g離心10 min。將上層血漿轉(zhuǎn)移到EP管中，-80 ℃冰箱中保存，待集中處理。將保存在-80 ℃的血漿于4 ℃解凍，2 500×g 離心20 min，去掉血小板和細(xì)胞碎片(重復(fù)2次)。然后將無(wú)血小板的血漿16 000×g低溫高速離心機(jī)(德國(guó) Eppdorf 公司)離心1 h，沉淀即為MPs，用PBS沖洗1次。BCA法(試劑盒購(gòu)自北京博凌科為生物科技有限公司)檢測(cè)MPs濃度。配制工作液：將50體積的試劑A與1體積的試劑B混合后即為標(biāo)準(zhǔn)工作試劑，呈嫩綠色。標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液配制：用待測(cè)樣品之緩沖液將濃度為2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品牛血清白蛋白(Bovine serum albumin, BSA)進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)蛊浣K濃度為2、1.5、1、0.75、0.5、0.25、0.125、0.025、0 mg/mL。將5 μL標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品與100 μL工作液混合，37 ℃ 30 min。將反應(yīng)管溫度冷卻至室溫，TECAN SUNRIS光吸收酶標(biāo)儀(奧地利 TECAN 公司)測(cè)定562 nm處光密度(OD)值。記錄所有樣品的OD值，使用Office Excel軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各樣品濃度。

1.3 SSM測(cè)定 所有患者用FibroScan 502通過(guò)瞬時(shí)彈性成像技術(shù)檢測(cè)SSM。由同1名專(zhuān)業(yè)醫(yī)師對(duì)AML患者在初診時(shí)、誘導(dǎo)化療后14 d檢測(cè)，之后每2個(gè)月檢測(cè)1次。對(duì)20例健康志愿者進(jìn)行SSM檢測(cè)。測(cè)量區(qū)域要求遠(yuǎn)離脾臟邊緣，無(wú)大血管結(jié)構(gòu)，脾臟有足夠的厚度，將掃描儀M探頭垂直于受檢者的皮膚表面，患者取側(cè)臥位，左上肢上舉，將探頭置于其左側(cè)左腋前線9～11肋間，檢測(cè)成功標(biāo)準(zhǔn)：檢測(cè)成功10次以上，四分位間距≤30%，成功率≥60%[7]，檢測(cè)值以Kpa表示。

2 結(jié)果

2.1 AML組與對(duì)照組MPs濃度比較 AML組、對(duì)照組MPs濃度分別為(8.04±2.66 )、(3.80±0.34)g/L，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-6.325，P=0.000)。

2.2 MPs濃度與AML患者臨床特征間的關(guān)系 見(jiàn)表1。

2.3 Kaplan-Meier生存分析 對(duì)表1中因素進(jìn)行篩選，MPs≥7.8 g/L者中位EFS短于MPs<7.8 g/L者(8個(gè)月 vs 27個(gè)月)；SSM≥35 Kpa者中位EFS短于SSM<35 Kpa者(8個(gè)月 vs 27個(gè)月)，隨染色體核型分級(jí)升高，中位EFS逐漸縮短(28、18、6個(gè)月)；FLT3-ITD+者中位EFS短于FLT3-ITD-者(6個(gè)月vs 20個(gè)月)，P均<0.05。隨外周血原始細(xì)胞比例及達(dá)CR1所需療程增加，中位EFS縮短，P<0.05。CD7+、CD123+、CD56+者中位EFS縮短，P<0.05，見(jiàn)表2。隨MPs、SSM升高，中位OS縮短(16個(gè)月 vs 38個(gè)月，16個(gè)月 vs 38個(gè)月)；隨染色體核型分級(jí)升高，OS顯著縮短，分別為38、27、15個(gè)月；隨年齡增長(zhǎng)、外周血原始細(xì)胞比例升高、達(dá)CR1所需化療療程增加，中位OS顯著縮短；FLT3-ITD+、CD56+者中位OS顯著縮短；P均<0.05，見(jiàn)表2。

表1 MPs濃度與AML患者臨床特征的關(guān)系

注：a代表Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。

MPs<7.8 g/L且FLT3-ITD-、MPs<7.8 g/L且FLT3-ITD+、MPs≥7.8 g/L且FLT3-ITD-、MPs≥7.8 g/L且FLT3-ITD+者中位EFS分別為28、18、12、4個(gè)月，P=0.000；中位OS分別為38、30、20、6個(gè)月，P=0.000。

MPs<7.8 g/L且SSM<35 Kpa、MPs<7.8 g/L且SSM≥35 Kpa、MPs≥7.8 g/L且SSM<35 Kpa、MPs≥7.8 g/L且SSM≥35 Kpa中位EFS分別為27、18、14、8個(gè)月，P=0.000；中位OS分別為38、30、26、16個(gè)月，P=0.000。

2.4 Cox回歸分析 進(jìn)一步將Log-rank檢驗(yàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的結(jié)果納入Cox模型中，發(fā)現(xiàn)染色體核型、FLT3-ITD突變、MPs是影響AML患者EFS的獨(dú)立預(yù)后因素(P分別為0.024、0.032、0.000，相對(duì)危險(xiǎn)度分別為2.039、2.794、5.857)。FLT3-ITD突變、MPs是影響AML患者OS的獨(dú)立預(yù)后因素(P分別為0.000、0.000，相對(duì)危險(xiǎn)度分別為11.806、10.460)。

3 討論

近年來(lái)，免疫標(biāo)記、細(xì)胞遺傳學(xué)、分子生物學(xué)異常等被用于AML患者的危險(xiǎn)度分層、預(yù)后評(píng)估。但AML有較強(qiáng)的異質(zhì)性，部分核型正常且無(wú)基因突變的AML患者預(yù)后評(píng)估尚缺乏特效方法。研究發(fā)現(xiàn)，白血病細(xì)胞衍生的MPs可轉(zhuǎn)運(yùn)白血病細(xì)胞膜受體進(jìn)入骨髓微環(huán)境中，促進(jìn)白血病細(xì)胞的增殖和存活，白血病細(xì)胞衍生MPs的表型與白血病的分型及臨床分期有關(guān)[8]。SSM檢測(cè)因無(wú)創(chuàng)、可重復(fù)操作等已被用于骨髓纖維化抗JCAK2治療效果的評(píng)估[6]。

表2 AML患者Cox量化模型賦值與單因素分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果(Log-rank檢驗(yàn))

研究報(bào)道，白血病細(xì)胞來(lái)源的MPs富含MMP9，能降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)白血病細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，增強(qiáng)白血病細(xì)胞的侵襲力[8]。在一項(xiàng)CLL實(shí)驗(yàn)中，CD61在Rai 0期患者血漿微泡中的表達(dá)量高達(dá)84%，在Rai I/Ⅱ期中表達(dá)量約60%，血漿中微泡的含量和Rai分期有關(guān)，且進(jìn)展期患者血漿中，表達(dá)CD52和CD20分子的MPs顯著增多，MPs與特異性抗體結(jié)合，直接導(dǎo)致阿侖單抗和利妥昔單抗耐藥，最終白血病進(jìn)展，患者生存期縮短[9]。我們發(fā)現(xiàn)，AML患者M(jìn)Ps高于對(duì)照組，與既往研究相符[8]。且高M(jìn)Ps與高齡、差染色體核型、較多達(dá)CR1所需化療療程等不良預(yù)后因素有關(guān)，且MPs濃度≥7.8 g/L組EFS、OS均顯著縮短，MPs是影響EFS、OS的獨(dú)立預(yù)后因素。高M(jìn)Ps者預(yù)后差。

FS因其具有無(wú)創(chuàng)、快速、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)在肝病領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[5]。研究發(fā)現(xiàn)，SSM或可用來(lái)預(yù)測(cè)HCV 感染失代償性肝硬化的發(fā)生[10]，SSM的檢測(cè)可預(yù)測(cè)食管胃底靜脈曲張破裂出血[5]。我們發(fā)現(xiàn)，SSM≥35 Kpa者EFS、OS短于SSM<35 Kpa者，且MPs濃度高于SSM<35 Kpa者，進(jìn)一步分組發(fā)現(xiàn)，無(wú)論SSM高低，MPs≥7.8 g/L者EFS、OS均短于MPs<7.8 g/L者，MPs<7.8 g/L且SSM≥35 Kpa者EFS、OS稍長(zhǎng)于MPs≥7.8 g/L且SSM<35 Kpa者，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，低MPs帶來(lái)的生存獲益或可被SSM升高所降低。

FMS 樣酪氨酸激酶 3(FLT3) 是一種刺激性生長(zhǎng)因子受體。FLT3-ITD基因突變，將導(dǎo)致酪氨酸激酶持續(xù)活化，使細(xì)胞發(fā)生自發(fā)性、非依賴性增殖，與腫瘤和白血病的發(fā)生密切相關(guān)，F(xiàn)LT3-ITD突變陽(yáng)性AML患者具有外周血白細(xì)胞數(shù)目及骨髓白血病細(xì)胞比例高的臨床特征，誘導(dǎo)緩解率低，EFS、OS短，預(yù)后差[2]。我們發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LT3-ITD+者M(jìn)Ps顯著高于FLT3-ITD-者，進(jìn)一步根據(jù)MPs及FLT3-ITD分組，MPs≥7.8 g/L者EFS、OS均短于MPs<7.8 g/L者，無(wú)論MPs濃度如何，F(xiàn)LT3-ITD+者EFS、OS短于FLT3-ITD-者，MPs≥7.8 g/L且FLT3-ITD+者生存期最短，由此推論FLT3-ITD突變或可促進(jìn)白血病細(xì)胞分泌MPs，但FLT3-ITD對(duì)AML預(yù)后的影響不依賴于MPs，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。研究報(bào)道，CD56+AML患者治療反應(yīng)差，首次化療后CR率、累積CR率、PFS、OS均低于對(duì)照組，誘導(dǎo)緩解后易復(fù)發(fā)，總體生存期短[11]。CD123是影響患者CR1及 OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1]，而CD7+與預(yù)后不相關(guān)[11]。我們發(fā)現(xiàn)，CD7+、CD123+、CD56+者中位EFS縮短，CD56+者中位OS縮短，且CD56+者M(jìn)Ps高于CD56-者。高M(jìn)Ps AML患者CD56表達(dá)增多，生存期短，預(yù)后差。

綜上所述,高M(jìn)Ps與高SSM、高齡、差染色體核型、達(dá)CR1所需療程增加、FLT3-ITD突變、CD56表達(dá)等因素有關(guān)，MPs是影響EFS、OS的獨(dú)立預(yù)后因素，聯(lián)合SSM檢測(cè)有助于評(píng)估患者預(yù)后。