腎細胞癌組織中HMGB1、RAGE表達變化及意義

孫祥生，王雪松，吳冰冰

鐵嶺市中心醫院，遼寧鐵嶺 112000

腎細胞癌(RCC)具有多種病理類型，惡性程度較高，易發生疾病轉移和復發[1]。近年來，腎細胞癌發病率呈逐年上升趨勢，由于腎癌細胞高表達耐藥基因，常規化療藥物對其無顯著療效。高遷移率族蛋白B1(HMGB1)是高遷移率族蛋白家族中一員，廣泛存在于全身各組織細胞中，具有多種生物學功能，如參與DNA的重組、修復、基因轉錄調控、細胞復制及分化成熟、誘導炎性反應等。研究表明，HMGB1在多種腫瘤中呈高度表達，如骨肉瘤、肝細胞癌、口腔鱗狀細胞癌、前列腺癌、胃腸道腫瘤等[2]，在癌癥進展和預后中亦起重要作用。晚期糖基化終末產物受體(RAGE)是最早發現的HMGB1受體[3]，其可與免疫球蛋白輕鏈、甲狀腺激素運載蛋白等結合，參與炎癥反應等病理生理過程，并通過介導HMGB1參與癌細胞的增殖、分化和遷移，在疾病發生發展過程中扮演重要角色[4]。2013年1月～2019年5月，我們檢測了腎細胞癌組織與癌旁組織中HMGB1和RAGE表達，并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年1月～2014年5月于我院住院治療的腎細胞癌患者88例，納入標準：①患者符合2009版中國泌尿外科疾病診斷與治療指南中腎細胞癌的診斷標準[5]，均經術后病理檢查明確診斷為腎細胞癌；②患者均為首次診斷腎細胞癌，既往未接受過任何方式的抗腫瘤治療；③患者臨床病理資料完整并接受隨訪，且均通過患者及家屬同意并簽署知情同意書。排除標準：①合并其他泌尿系統疾病，如腎炎、泌尿系統感染等；②合并惡性腫瘤。88例患者中男46例、女42例，年齡46～77(65.1±7.7)歲；TNM分期：Ⅰ期20例，Ⅱ期13例，Ⅲ期38例，Ⅳ期17例；病理分化程度：中低分化53例，高分化35例；有淋巴結轉移53例；腫瘤直徑<4 cm 26例，≥4 cm 62例。其中TNM分期及病理分化程度參考第八版美國癌癥聯合會標準[6]。

1.2 腎細胞癌組織與癌旁組織中HMGB1和RAGE表達檢測 采用SP法檢測腎癌組織及其癌旁組織(距腫瘤邊緣大于5 cm)HMGB1和RAGE表達。將手術切除的組織石蠟包埋后制成厚度為5 μm的切片，經二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟后乙醇梯度水化，PBS浸洗3次，每次5 min，避光條件下3% H2O2滅活內源性過氧化物酶10 min，PBS清洗3次。將切片放0.01 mol/L(pH 6.0)檸檬酸緩沖液浸泡，100 ℃水浴30 min，自然冷卻后PBS清洗，滴加5%兔血清白蛋白封閉液，37 ℃孵育20 min，濾紙吸去血清，滴加HMGB1和RAGE一抗37 ℃孵育2 h，PBS清洗后滴加辣根過氧化物酶標記的二抗37 ℃孵育1 h，PBS清洗后滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素親和素37 ℃孵育15 min，PBS清洗后DAB顯色5 min，蘇木紫復染1 min，再乙醇梯度水化，中性樹膠封片。最后顯微鏡鏡檢(×400)。顯微鏡鏡檢中，每張切片選取15個視野，每100個細胞中HMGB1和RAGE陽性細胞數的平均數作為細胞陽性率，并將15個視野平均值作為最終結果。結果判讀參考文獻[7]：根據染色強度和細胞陽性百分數綜合打分，0～2分視為陰性，3～6分為陽性。

1.3 統計學方法 采用SPSS22.0統計軟件。計數資料以例數或率描述，采用χ2檢驗進行分析。相關性分析使用Spearman相關分析法。建立Kaplan-Meier乘積限模型進行生存分析，兩組生存率比較采用Log-rank檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腎細胞癌組織與癌旁組織中HMGB1與RAGE表達比較 腎細胞癌組織中，HMGB1主要表達于細胞核或細胞質，免疫組化HMGB1表達陽性細胞呈棕黃色染色。腎細胞癌、癌旁組織中HMGB1陽性表達率分別為87.5%(77/88)、20.4%(18/88)，二者比較差異有統計學意義(χ2=79.617，P=0.000)。

腎細胞癌組織中，RAGE主要表達于細胞膜上，免疫組化RAGE表達陽性細胞呈棕色染色。腎細胞癌、癌旁組織中RAGE陽性表達率分別為82.9%(73/88)、22.7%(20/88)，二者比較差異有統計學意義(χ2=64.048，P<0.001)。

2.2 腎細胞癌組織中HMGB1與RAGE表達的相關性 Spearman相關分析示，腎細胞癌組織中HMGB1與RAGE表達呈正相關(r=0.673，P<0.001)。

2.3 腎細胞癌組織中HMGB1和RAGE表達與患者臨床病理特征間的關系 腎細胞癌組織中HMGB1、RAGE蛋白表達與腫瘤臨床TNM分期、分化程度及淋巴結轉移有關(P均<0.001)。見表1。

表1 腎細胞癌組織中HMGB1和RAGE表達與患者臨床病理特征間的關系(例)

2.4 腎細胞癌組織中HMGB1、RAGE表達與患者預后的關系 截至2019年5月， 88例腎細胞癌患者均成功隨訪3～60個月，無失訪案例，29例患者5年內死亡，5年生存率為67.0%。HMGB1陽性77例，其中死亡28例，5年生存率為63.6%(49/77)；HMGB1陰性11例，其中死亡1例，5年生存率為90.9%(10/11)。經Log-rank檢驗，χ2= 4.738，P=0.028。

RAGE陽性73例，其中死亡27例，5年生存率為63.0%(46/73)；RAGE陰性15例，其中死亡2例，5年生存率為86.6%(13/15)。經Log-rank檢驗，χ2= 4.383，P=0.036。

3 討論

腎細胞癌在腎臟惡性腫瘤中約占90%，在成人癌癥中占2%～3%[8]。吸煙、肥胖、終末期腎功能衰竭、透析均是腎細胞癌的危險因素[9]。目前腎細胞癌主要治療方式包括手術、放療、化療及分子靶向治療等，大部分腎細胞癌能被及時發現，但仍有部分患者發現時已處于癌癥晚期，預后差，易復發，患者長期生存率低[8]。

HMGB1是一種細胞外信號分子，在真核細胞核中大量存在[10]，人HMGB1基因位于染色體13q12上，由兩個DNA結合位點(A-box和B-box)和帶負電的C-末端組成[11]。HMGB1在DNA修復和轉錄、信號傳導及體細胞重組中發揮重要作用，如HMGB1與DNA結合，影響某些基因(p53、類固醇激素受體)的轉錄過程。有研究發現，HMGB1可促進腎癌細胞的增殖和發展，而抑制HMGB1表達卻可增強癌細胞的凋亡[12]。本研究結果顯示，腎細胞癌組織中HMGB1高表達。可能是高表達HMGB1引起腫瘤表型基因高表達，從而導致腫瘤基因的產生，進一步促進腫瘤發生發展[13]；同時，壞死的腫瘤細胞將HMGB1釋放至細胞外，促進周圍腫瘤細胞增殖分化和血管生成，使得腫瘤組織持續增大。本研究發現，腎細胞癌組織中HMGB1表達與腫瘤TNM分期、分化程度及淋巴結轉移有關。癌細胞侵襲周圍組織或發生淋巴結轉移是腫瘤患者死亡的主要原因。腫瘤細胞侵襲周圍正常組織，且發生血液和淋巴結轉移，隨著血液和淋巴結循環轉移至各個靶器官，在炎癥或其他因子的刺激下，腫瘤細胞可分泌出更多的HMGB1蛋白，HMGB1與RAGE、TLR2/4受體結合，激活p38、SPA/JNK、NF-κB等信號通路，進一步激活產生金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9和凋亡抑制蛋白c-IAP等[14]，纖維蛋白溶酶級聯激活金屬蛋白酶，降解細胞外基質，使癌細胞浸潤、轉移到周圍正常組織中，從而進一步促進腫瘤的發生發展[15]。

RAGE是多種不同結構分子的配體，是一種跨膜蛋白，由N端、疏水的跨膜段及C端組成。相關研究表明[16]，RAGE在多種腫瘤細胞中均有升高，在腫瘤侵襲、轉移過程中發揮作用，且腫瘤組織中RAGE表達遠高于癌旁組織，本研究結果與之相同，其機制可能為上調RAGE基因表達時，抑癌基因p53 磷酸化減弱，bcl-2和bcl-xL抗凋亡蛋白表達上調，阻斷腫瘤細胞凋亡[17]。本研究結果還顯示，腎細胞癌組織中RAGE陽性表達率與腫瘤臨床分期、分化程度有關，其機制可能為HMGB1-RAGE軸在腫瘤進展過程中發揮重要作用，癌細胞自分泌大量的HMGB1分子，從而激活受體RAGE的產生，通過激活下游信號通路產生炎癥因子，促使腫瘤細胞產生抗細胞凋亡基因、提高對細胞內缺氧狀態的耐受能力、干擾抗腫瘤免疫反應，促進腫瘤細胞增殖，形成正向調控。當下調RAGE的表達時可使腫瘤的分化功能喪失，腫瘤分化程度降低，促使腫瘤惡性程度進一步升高[18]。本研究中，腎細胞癌患者RAGE陽性表達率與淋巴結轉移有關，機制可能為RAGE具有高遷移能力，當晚期糖基化終末產物、HMGB1或鈣粒蛋白等配體與其結合后，同樣激活了細胞內NF-κB等信號轉導通路，使癌細胞逐漸向周圍正常組織中轉移[15]，降解正常組織，促進腫瘤轉移，加快腫瘤細胞的浸潤性生長。

本研究結果顯示，HMGB1與RAGE表達陽性患者5年生存率均低于陰性者，表明HMGB1、RAGE高表達可能與腎細胞癌患者的不良預后有關。本研究結果顯示，HMGB1與RAGE表達呈正相關，HMGB1是RAGE最重要的配體，結合后可激活重要的信號通路[15]，如SPA/JNK、NF-κB等。因此二者在癌癥發生發展過程中協同發揮作用。

綜上所述，腎細胞癌組織中HMGB1與RAGE表達均升高，檢測二者表達有助于患者病情判斷及預后評估。