硒納米顆粒治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠效果觀察及抗炎機(jī)制

任世祥,趙瀟雄,陳彤,周磊,馬德思,溫亮,王志為,林源,張博

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院，北京100020

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種臨床常見(jiàn)的自身免疫性疾病，患者早期臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腫脹、行動(dòng)不便等，若病情未及時(shí)得到控制，則患者很可能會(huì)出現(xiàn)關(guān)節(jié)強(qiáng)直甚至畸形，嚴(yán)重影響患者的身體健康及生活質(zhì)量[1,2]。硒元素是一種機(jī)體正常運(yùn)轉(zhuǎn)必不可少的微量元素，缺少硒元素會(huì)導(dǎo)致機(jī)體重要器官的正常運(yùn)轉(zhuǎn)出現(xiàn)異常，從而導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生[3]。有學(xué)者認(rèn)為，類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎癥狀發(fā)生是由于患者免疫功能下降，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)出現(xiàn)炎癥反應(yīng)。硒元素是一種強(qiáng)效的免疫調(diào)節(jié)劑，能作為一種非特異刺激因素對(duì)機(jī)體體液免疫及細(xì)胞免疫系統(tǒng)進(jìn)行有效刺激，從而一定程度上增強(qiáng)患者免疫能力[4]。目前為止，國(guó)內(nèi)外鮮有關(guān)于硒納米顆粒干預(yù)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎癥狀的研究。2018年5月，我們構(gòu)建類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠模型，并使用硒納米顆粒進(jìn)行干預(yù)，旨在探究硒納米顆粒對(duì)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠的治療效果及抗炎機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 動(dòng)物：30只SD健康雄性大鼠，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，3～6月齡，體質(zhì)量200～250(220±7.9)g。大鼠均養(yǎng)殖于干凈籠子中，室溫(22.1±1.8)℃，相對(duì)濕度35%～40%，每天光照12 h，喂飲純凈水，飼養(yǎng)時(shí)間為1周。主要試劑：硒納米顆粒(Hyclone公司)；小鼠抗小鼠谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)抗體(Gibco公司)；兔抗大鼠COX-2抗體(Invitrogen公司)；蘇木素(天根生化科技有限公司)；TBST緩沖液、BCA蛋白定量試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 建模及處理 取30只大鼠，10只不作任何干預(yù)，正常飼養(yǎng)，作為對(duì)照組；另外20只構(gòu)建類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型。使用10%的水合氯醛對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，并將其按仰臥姿勢(shì)置于操作臺(tái)上，將頭部及四肢進(jìn)行固定。使用0.1 mol/L的醋酸將Ⅱ型膠原進(jìn)行溶解并將其配制成2 mg/mL的Ⅱ型膠原溶液，并對(duì)大鼠的背部、尾根部及左后足跖皮內(nèi)進(jìn)行注射，每只大鼠注射0.25 mL,注射1 min后松開(kāi)固定繩，將大鼠放回籠中使其自然蘇醒。建模處理后大鼠出現(xiàn)多發(fā)性關(guān)節(jié)腫脹視為類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型建立成功，最終建模失敗1只，成功19只。將19只類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型大鼠隨機(jī)分為類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎組10只和硒納米顆粒組9只。對(duì)硒納米顆粒組大鼠使用硒納米顆粒溶液6 mg/kg進(jìn)行灌胃處理，1次/d，連續(xù)處理3周；類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎組大鼠使用生理鹽水進(jìn)行灌胃處理，用法用量與硒納米顆粒組保持一致。三組大鼠在月齡、體質(zhì)量上均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)。

1.3 足體積測(cè)量 對(duì)三組大鼠進(jìn)行足體積測(cè)量，使用足趾容積測(cè)量?jī)x，每5 d測(cè)量1次，共測(cè)量4次，對(duì)比三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)足體積變化情況。

1.4 關(guān)節(jié)炎指數(shù)計(jì)算 關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)紅腫為0分；小趾關(guān)節(jié)輕度紅腫為1分；小趾關(guān)節(jié)和足跖腫脹為2分；踝關(guān)節(jié)下指甲腫脹為3分；所有指甲、關(guān)節(jié)腫脹為4分。按此標(biāo)準(zhǔn)對(duì)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎組和硒納米顆粒組大鼠四肢病變程度進(jìn)行評(píng)價(jià)，并累計(jì)積分，每5天評(píng)價(jià)1次，計(jì)算關(guān)節(jié)炎指數(shù)。

1.5 大鼠關(guān)節(jié)病理組織學(xué)觀察 類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎組和硒納米顆粒組大鼠采用斷頭法處死，取大鼠的雙側(cè)踝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨標(biāo)本，置于4%的多聚甲醛中固定，10%的EDTA中進(jìn)行脫鈣，矢狀位取材，進(jìn)行常規(guī)脫水石蠟包埋，切片備用。對(duì)大鼠切片樣本進(jìn)行HE染色處理，使用二甲苯進(jìn)行常規(guī)脫蠟處理2次，每次5 min，然后在梯度乙醇下水化處理3 min，自來(lái)水沖洗1次；使用蘇木素染色5 min，自來(lái)水沖洗1次；用濃度為1%的鹽酸乙醇分化處理30 s，在0.2%氨水中反藍(lán)處理2 min，自來(lái)水沖洗1次；用濃度0.5%伊紅染色10 min，自來(lái)水沖洗1次；梯度乙醇脫水處理，最后用中性樹(shù)膠封片，使用光學(xué)顯微鏡分析圖像。

1.6 血清IL-6、TNF-α相對(duì)表達(dá)量檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法。分別取三組大鼠尾部靜脈血5 mL,在抗凝管中保存，3 000 r/min，離心20 min，放入潔凈的EP試管中，分離上層血清，-80 ℃中保存。50 mmol/L碳酸鹽包被緩沖液將抗原進(jìn)行溶解，濃度為10～20 μg/mL，96孔酶標(biāo)板中加入100 μL/孔，4 ℃過(guò)夜保存。第2天舍棄包被液，采用PBST洗滌3次，每孔中加入1%的BSA 150 μL，37 ℃中封閉1 h。之后采用PBST洗滌3次，在每孔中加入100 μL不同倍比稀釋度的血清，加入對(duì)照樣品，37 ℃孵育2 h。采用PBST洗滌5次，加入100 μL,稀釋后HRP標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育1 h。PBST洗滌5次，之后，使用顯色劑顯色20 min，在酶標(biāo)儀上讀取405 nm處吸光度值(A值)。

1.7 血清GSH-Px、COX-2相對(duì)表達(dá)量檢測(cè) 采用Western blotting法。分別取三組大鼠尾部靜脈血5 mL,在抗凝管中保存，3 000 r/min，離心20 min，放入潔凈的EP試管中，分離上層血清，-80 ℃中保存，待用。用SDS-PAGE凝膠將待測(cè)標(biāo)本進(jìn)行電泳，加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白緩沖液，靜置15 min；在100 V的環(huán)境中電泳10 min后，將電轉(zhuǎn)膜置于37 ℃封閉環(huán)境中的搖床上，然后加入10%的牛奶，靜置1.5 h后加入TBST稀釋?zhuān)?1∶1 000)稀釋?zhuān)? ℃下，孵育后過(guò)夜保存；第2天使用TBST緩沖液清洗，在室溫環(huán)境中與二抗結(jié)合，孵育1 h后再次用TBST緩沖液清洗，最后將其浸泡在底物溶液中進(jìn)行顯色，采用BCA蛋白定量試劑盒，分析其灰度值，目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值=目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 大鼠關(guān)節(jié)病理組織學(xué)觀察 如圖1所示，類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎組大鼠滑膜組織出現(xiàn)充血現(xiàn)象，細(xì)胞排列不規(guī)則，出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的現(xiàn)象；硒納米顆粒組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織受損情況及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)相比類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎組大鼠出現(xiàn)緩解。

圖1 兩組大鼠關(guān)節(jié)病理組織學(xué)觀察(HE染色，×200)

2.2 三組大鼠不同時(shí)點(diǎn)足體積比較 見(jiàn)表1。

2.3 兩組不同時(shí)點(diǎn)大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)變化比較 見(jiàn)表2。

表1 三組大鼠不同時(shí)點(diǎn)足體積比較

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎組相比，#P<0.05。

表2 兩組不同時(shí)點(diǎn)大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)變化比較

注：與類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎組相比，#P<0.05。

2.4 三組大鼠不同時(shí)點(diǎn)IL-6、TNF-α相對(duì)表達(dá)量比較 見(jiàn)表3。

2.5 三組大鼠不同時(shí)點(diǎn)血清GSH-Px、COX-2相對(duì)表達(dá)量比較 見(jiàn)表4。

3 討論

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種慢性系統(tǒng)性自身免疫性疾病，是一種以炎性滑膜炎為主的慢性炎癥[5]。類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎癥狀會(huì)對(duì)患者的身體健康和生活質(zhì)量造成一定威脅，若患者未及時(shí)接受治療，類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎癥狀未得到及時(shí)控制，病情發(fā)展嚴(yán)重，可能會(huì)出現(xiàn)患者關(guān)節(jié)畸形等惡劣后果[6]。

臨床醫(yī)學(xué)研究中對(duì)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎癥狀的發(fā)病機(jī)制及誘因尚未明確，有專(zhuān)家認(rèn)為類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎癥狀與遺傳、感染及激素分泌有關(guān)，會(huì)造成微小血管的新生、細(xì)胞的增殖及骨組織損壞等[7,8]。目前能對(duì)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎癥狀進(jìn)行安全有效治療的藥物較少，所以，如何對(duì)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎癥狀進(jìn)行治療是臨床醫(yī)學(xué)的一大難題[9,10]。

表3 三組大鼠不同時(shí)點(diǎn)IL-6、TNF-α相對(duì)表達(dá)量比較

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎組相比，#P<0.05。

表4 三組大鼠不同時(shí)點(diǎn)血清GSH-Px、COX-2相對(duì)表達(dá)量比較

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎組相比，#P<0.05。

硒元素是一種機(jī)體正常運(yùn)轉(zhuǎn)必不可少的微量元素，且硒元素被中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)列入人體所必須的營(yíng)養(yǎng)元素[11]。諸多專(zhuān)家學(xué)者通過(guò)大量臨床實(shí)驗(yàn)研究證明，缺少硒元素會(huì)導(dǎo)致機(jī)體重要器官的正常運(yùn)轉(zhuǎn)出現(xiàn)異常，從而導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生。有學(xué)者認(rèn)為。類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎癥狀發(fā)生，是由于患者免疫功能下降，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)出現(xiàn)炎癥反應(yīng)。硒元素是一種強(qiáng)效的免疫調(diào)節(jié)劑，能作為一種非特異刺激因素對(duì)機(jī)體體液免疫及細(xì)胞免疫系統(tǒng)進(jìn)行有效刺激，從而一定程度上增強(qiáng)患者免疫能力[12]。本研究結(jié)果顯示，在使用硒納米顆粒進(jìn)行干預(yù)后，類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型大鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)下降，說(shuō)明使用硒納米顆粒對(duì)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠進(jìn)行干預(yù)，大鼠體內(nèi)的硒元素得到補(bǔ)充，提高了大鼠的體液免疫及細(xì)胞免疫功能，從而緩解了類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型大鼠的炎癥反應(yīng)嚴(yán)重程度，起到治療效果。

GSH-Px是機(jī)體一種重要的過(guò)氧化物分解酶[13]，硒半胱氨酸是GSH-Px的活性中心，所以GSH-Px活性的大小能直接反映出機(jī)體硒元素的含量。GSH-Px作為一種重要的過(guò)氧化物酶，能將機(jī)體內(nèi)的過(guò)氧化氫及對(duì)機(jī)體有害的過(guò)氧化代謝產(chǎn)物清除，阻斷機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化連鎖反應(yīng)，從而保護(hù)機(jī)體細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能的完整性。COX-2由604個(gè)氨基酸組成，定位于細(xì)胞核膜，在多數(shù)組織中無(wú)表達(dá)，而在機(jī)體腦、腎、輸精管及妊娠后胎盤(pán)中有定量表達(dá)，參與了排精、排卵及分娩等功能發(fā)生的過(guò)程，且生長(zhǎng)因子、致炎因子等多種因素能誘導(dǎo)COX-2在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中表達(dá)，參與炎癥反應(yīng)，對(duì)損傷組織及機(jī)體免疫功能的修復(fù)起到促進(jìn)作用[14,15]。本研究結(jié)果顯示，使用硒納米顆粒對(duì)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型大鼠進(jìn)行干預(yù)，能對(duì)大鼠血清GSH-Px、COX-2的水平進(jìn)行明顯調(diào)控。IL-6、TNF-α是兩種常用的炎癥因子。IL-6能誘導(dǎo)其產(chǎn)生的來(lái)源范圍較廣，大量實(shí)驗(yàn)資料表明，IL-6在人體中參與多種炎癥反應(yīng)和疾病，是一種重要的促炎因子。TNF-α能影響身體的抗感染力，病毒感染或細(xì)菌感染越重，TNF-α水平就越高。在一般情況下可根據(jù)患者身體內(nèi)的TNF-α水平來(lái)判斷病情的嚴(yán)重程度。本研究結(jié)果顯示，類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠血清IL-6、TNF-α呈現(xiàn)異常高表達(dá)，在使用硒納米顆粒進(jìn)行干預(yù)后，類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠血清IL-6、TNF-α水平得到明顯調(diào)控，可能是因?yàn)槭褂梦{米顆粒進(jìn)行干預(yù)，對(duì)血清GSH-Px、COX-2水平進(jìn)行調(diào)控，從而改善了模型大鼠的過(guò)氧化損傷及免疫能力，進(jìn)而減輕了類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠的炎癥反應(yīng)，起到了抗炎作用。

綜上所述，硒納米顆粒能有效改善類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型大鼠的病情嚴(yán)重程度，并能通過(guò)調(diào)控血清GSH-Px、COX-2表達(dá)起到抗炎作用。