丹參川芎嗪對(duì)糖尿病大鼠神經(jīng)病理性疼痛的改善效果觀察

陳波，劉文雄

西安市西電集團(tuán)醫(yī)院，西安710077

神經(jīng)病理性疼痛是糖尿病最為常見且危害最為嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥之一，主要表現(xiàn)為周圍神經(jīng)感覺(觸覺和痛覺)及自主神經(jīng)異常[1,2]。在我國(guó)，約有近50%的糖尿病患者存在糖尿病神經(jīng)病理性疼痛，且發(fā)病率隨糖尿病患病時(shí)間延長(zhǎng)而增加[3]。目前，臨床常用的治療糖尿病神經(jīng)病理性疼痛的藥物主要包括抗驚厥藥物(如加巴噴丁、普瑞巴林等)、抗抑郁類藥物(如阿米替林、帕羅西汀等)及離子通道阻斷藥物，但這些藥物對(duì)于糖尿病神經(jīng)病理性疼痛的癥狀緩解效果不甚滿意[4]。川芎嗪是中藥川芎的主要有效成分，其藥效報(bào)道最多的是對(duì)于心血管細(xì)胞的積極作用效果，具有保護(hù)心肌細(xì)胞、對(duì)抗心肌炎癥反應(yīng)、擴(kuò)張血管、降低血液黏稠度等功效[5,6]。丹參素作為唇形科植物丹參干燥根/莖的有效成分，在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、心絞痛等心血管疾病領(lǐng)域有積極的治療效果[7,8]。近年來出現(xiàn)了丹參川芎嗪注射液等復(fù)方制劑，其不僅在高血壓、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、腦供血不足、腦血栓等心腦血管疾病中有明顯的治療效果[9]，且有較好消炎鎮(zhèn)痛效應(yīng)[10]。丹參川芎嗪對(duì)神經(jīng)病理性疼痛的治療效果得到部分實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，但丹參川芎嗪能否緩解糖尿病神經(jīng)病理性疼痛，目前尚未見系統(tǒng)的研究報(bào)道。2018年7月，我們通過腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)構(gòu)建糖尿病大鼠模型，通過疼痛閾值、神經(jīng)傳導(dǎo)速率、重要細(xì)胞因子表達(dá)檢測(cè)探究丹參川芎嗪對(duì)糖尿病大鼠神經(jīng)病理性疼痛的治療效果。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性SPF級(jí)Sprague Dawley大鼠(3月齡)30只，體質(zhì)量275 ～290 g，購(gòu)于空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。鏈脲佐菌素(STZ)溶液購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；戊巴比妥鈉溶液購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；丹參川芎嗪注射液購(gòu)于吉林四長(zhǎng)制藥有限公司；便攜式血糖測(cè)試分析儀購(gòu)于美國(guó)Lifescan公司；Von Frey纖毛購(gòu)于美國(guó)Stoelting公司；熱痛敏刺激和測(cè)量系統(tǒng)購(gòu)于意大利Commat公司。生物信號(hào)采集系統(tǒng)購(gòu)于成都泰盟科技有限公司。cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于北京天根生物技術(shù)公司；Maxima SYBR Green qPCR試劑盒購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher公司；RNA提取試劑TRIzol購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司。

1.2 動(dòng)物模型構(gòu)建和實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)室溫度維持在23 ℃左右，濕度維持在50%，12 h晝/夜循環(huán)照明，動(dòng)物自由飲水和進(jìn)食。通過腹腔注射STZ溶液(55 mg/kg)的方式構(gòu)建糖尿病大鼠模型，注射72 h后通過血糖測(cè)量?jī)x檢測(cè)各組大鼠隨機(jī)血糖值，血糖值高于14.0 mmol/L且表現(xiàn)出多飲、多食、多尿特征的大鼠被認(rèn)定為糖尿病建模成功。將30只大鼠隨機(jī)分為3組，每組10只，包括空白對(duì)照組(Control組)、糖尿病組(DM組)及糖尿病協(xié)同丹參川芎嗪治療組(DM+SML組)。于STZ注射的72 h后(造模鑒定成功)腹腔注射丹參川芎嗪注射液，劑量為2 mL/kg，每天注射1次，連續(xù)注射8周。

1.3 大鼠足底機(jī)械痛閾值測(cè)定 于糖尿病模型鑒定完畢的(STZ注射72 h后)第0、2、4、6、8周,分別測(cè)定各組大鼠的足底機(jī)械痛閾值。將大鼠置于樹脂有機(jī)玻璃罩中，底部帶有金屬網(wǎng)，測(cè)試前大鼠適應(yīng)該環(huán)境至少30 min。通過使用Von Frey纖維絲以自下而上的順序刺激大鼠足底中部，使纖維發(fā)生彎曲，大鼠出現(xiàn)明顯的縮足反應(yīng)時(shí)計(jì)為陽(yáng)性。重復(fù)該刺激動(dòng)作，直至測(cè)量?jī)x先后5次記錄到類似的測(cè)試值(測(cè)試間隔不低于10 s)，取5次記錄的平均值作為該只大鼠單側(cè)足底的機(jī)械縮足反應(yīng)閾值，每只大鼠均進(jìn)行雙側(cè)足底測(cè)定。

1.4 大鼠足底熱痛閾值的測(cè)定 于糖尿病模型鑒定完畢的(STZ注射72 h后)第0、2、4、6、8周，分別測(cè)定各組大鼠的足底熱痛閾值。將實(shí)驗(yàn)大鼠置于有機(jī)玻璃籠中，測(cè)試前大鼠適應(yīng)該環(huán)境至少30 min。使用熱輻射測(cè)痛儀對(duì)動(dòng)物足底中心位置進(jìn)行熱光束刺激，大鼠因難以耐受熱痛出現(xiàn)抬足反應(yīng)，此時(shí)光束會(huì)自動(dòng)切斷并自動(dòng)記錄反應(yīng)時(shí)間。每只大鼠的每側(cè)足底共刺激5次(雙側(cè)共10次)，每次間隔10 min，記錄10次的測(cè)量值并取其平均值。

1.5 大鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速率的測(cè)定 于糖尿病模型鑒定完畢的(STZ注射72 h后)第0、2、4、6、8周，分別測(cè)定各組大鼠的足底機(jī)械痛閾值。腹腔注射戊巴比妥鈉溶液(30 mg/kg)對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉。將大鼠置于鋪有輔助加熱裝置的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上。將兩個(gè)刺激電極分別插入大鼠的踝關(guān)節(jié)和坐骨切跡上。待電極植入穩(wěn)定后，對(duì)刺激電極通入電流，采用生物信號(hào)采集系統(tǒng)記錄復(fù)合動(dòng)作電位的潛伏期(神經(jīng)傳導(dǎo)時(shí)間)，同時(shí)測(cè)定記錄電極和刺激電極間沿著神經(jīng)走向的間隔距離，計(jì)算獲得感覺神經(jīng)的傳導(dǎo)速率。

1.6 大鼠脊髓p38MAPK和IL-1β基因表達(dá)測(cè)定 于丹參川芎嗪治療8周后，處死各組大鼠，通過RNA提取試劑盒提取大鼠腰段脊髓L5背角總RNA，隨后按試劑盒說明書步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，使用Bio-Rad CFX96對(duì)所選取的目標(biāo)基因進(jìn)行測(cè)定，使用GAPDH作為內(nèi)參基因。p38MAPK正向引物：5′-TCCAAGGGCTACACCAAATC-3′，反向引物：5′-TGTTCCAGGTAAGGGTGAGC-3′；IL-1β正向引物：5′-TGATGTTCCCATTAGACAGC-3′，反向引物：5′-GAGGTGCTGATGTACCAGTT-3′。使用2-ΔΔCT法對(duì)p38MAPK和IL-1β的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié)果

2.1 丹參川芎嗪對(duì)糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠隨機(jī)血糖的影響 見表1。

表1 三組不同時(shí)點(diǎn)隨機(jī)血糖比較

注：與 Control組相比，*P<0.05。

2.2 丹參川芎嗪對(duì)糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠足底機(jī)械痛閾值和熱痛閾值的影響 見表2、3。

表2 三組不同時(shí)點(diǎn)足底機(jī)械痛閾值比較

注：與Control組相比，*P<0.05；與DM組相比，#P<0.05。

表3 三組不同時(shí)點(diǎn)足底熱痛閾值比較

注：與Control組相比，*P<0.05；與DM組相比，#P<0.05。

2.3 丹參川芎嗪對(duì)糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速率的影響 見表4。

表4 三組不同時(shí)點(diǎn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速率比較

注：與Control組相比，*P<0.05；與DM組相比，#P<0.05。

2.4 丹參川芎嗪對(duì)糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓p38MAPK和IL-1β基因表達(dá)的影響 Control組、 DM組、DM+SML組大鼠脊髓p38MAPK基因相對(duì)表達(dá)量分別為1.0±0.4、5.4±0.9、2.1±0.6，IL-1β基因相對(duì)表達(dá)量分別為1.0±0.4、3.9±0.8、1.8±0.8。與Control組相比，DM組大鼠的脊髓p38MAPK和IL-1β基因表達(dá)均升高(P均<0.01)。而DM+SML組大鼠脊髓p38MAPK和IL-1β基因表達(dá)低于DM組(P均<0.01)。

3 討論

神經(jīng)病理性疼痛作為糖尿病最為常見且危害最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，嚴(yán)重影響糖尿病患者的生理和心理健康。糖尿病神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生機(jī)制與長(zhǎng)期慢性高血糖引發(fā)的代謝紊亂、微循環(huán)障礙、神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等因素相關(guān)[11]。目前臨床應(yīng)對(duì)糖尿病神經(jīng)病理性疼痛主要措施是控制血糖配合鎮(zhèn)痛、抗驚厥和抗抑郁藥物，但治療效果仍不佳。丹參川芎嗪已被證實(shí)具有降低血液黏度、改善微循環(huán)、擴(kuò)張心腦血管、抗血小板聚集等功效，并已廣泛用于心腦血管缺血、心肌梗死、腦血栓的治療[9,12]。最新研究發(fā)現(xiàn)，丹參川芎嗪亦具有抗菌消炎及緩解神經(jīng)病理性疼痛的作用[10]。

STZ能迅速破壞胰島中的β細(xì)胞，從而顯著降低β細(xì)胞介導(dǎo)的胰島素分泌，引起機(jī)體血糖的持續(xù)升高和漸進(jìn)的糖尿病癥狀。本研究中，我們通過腹腔注射STZ的方式構(gòu)建糖尿病模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，STZ注射后的72 h開始(第0周)，糖尿病大鼠即開始出現(xiàn)足底機(jī)械痛閾值和熱痛閾值的顯著降低，且糖尿病大鼠的足底機(jī)械痛閾值和熱痛閾值在整個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)程中一直維持較低水平。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與既往研究結(jié)果一致，提示STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠出現(xiàn)與糖尿病患者類似的疼痛閾值降低的表征[13,14]。另外，我們發(fā)現(xiàn)丹參川芎嗪注射液從第2周開始表現(xiàn)出對(duì)足底機(jī)械痛閾值和熱痛閾值的顯著改善效果，并且該種改善效果隨治療時(shí)程的推進(jìn)愈加顯著。提示丹參川芎嗪對(duì)糖尿病機(jī)體的疼痛敏感性退化有顯著改善效應(yīng)。

糖尿病患者通常表現(xiàn)出周圍神經(jīng)的顯著受損，而糖尿病患者的感覺神經(jīng)異常通常早發(fā)于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)，下肢受累重于上肢，而臨床通過使用運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)功能檢測(cè)來診斷發(fā)現(xiàn)糖尿病患者的周圍神經(jīng)病變[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，STZ注射的大鼠表現(xiàn)出運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速率顯著降低，進(jìn)一步證實(shí)糖尿病大鼠表現(xiàn)出顯著的神經(jīng)病理性病變的相關(guān)癥狀。另外，我們發(fā)現(xiàn)丹參川芎嗪治療2周即開始對(duì)糖尿病大鼠的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速率產(chǎn)生顯著的提升效果，且這種積極的治療效果隨治療時(shí)程的推進(jìn)愈加顯著。進(jìn)一步證實(shí)丹參川芎嗪對(duì)糖尿病神經(jīng)病變的顯著改善效應(yīng)。

大量研究揭示，MAPKs信號(hào)通路在疼痛的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，而近年來研究也發(fā)現(xiàn)，MAPKs信號(hào)同樣介導(dǎo)糖尿病神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展，糖尿病神經(jīng)病理性疼痛與脊髓、脊髓背根神經(jīng)節(jié)、坐骨神經(jīng)節(jié)中的MAPKs過度激活密切相關(guān)[16]。而p38MAPK作為MAPKs中的重要亞型，在糖尿病神經(jīng)病變中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，STZ注射的糖尿病大鼠脊髓中的p38MAPK同樣呈現(xiàn)過表達(dá)狀態(tài)。而丹參川芎嗪注射液治療8周后，糖尿病大鼠的脊髓p38MAPK表達(dá)顯著降低，其值接近Control組，此進(jìn)一步揭示p38MAPK表達(dá)抑制可能在丹參川芎嗪緩解糖尿病神經(jīng)病理性疼痛中發(fā)揮重要作用。另外，我們發(fā)現(xiàn)IL-1β在糖尿病大鼠脊髓中的表達(dá)高于對(duì)照，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，揭示糖尿病大鼠的脊髓組織處于高炎性因子表達(dá)狀態(tài)，丹參川芎嗪能顯著抑制糖尿病大鼠脊髓組織中IL-1β表達(dá)，提示丹參川芎嗪對(duì)糖尿病神經(jīng)病變的改善效果與其自身的抗炎性效應(yīng)有關(guān)。

綜上所述，丹參川芎嗪可有效改善糖尿病大鼠神經(jīng)病理性疼痛的相關(guān)癥狀，提高足底機(jī)械痛閾值、熱痛閾值及運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速率，抑制糖尿病大鼠脊髓組織中p38MAPK、IL-1β表達(dá)。