食管鱗癌患者血漿miR-424、miR-92a及miR-130b水平變化及意義

梁衛東，曾小飛，吳鵬，周家田，顏神超

成都醫學院第一附屬醫院,成都 610500

食管癌是世界上常見的高病死率惡性腫瘤之一[1]，食管鱗癌是其主要組織學亞型。由于食管鱗癌早期缺乏特異性癥狀及體征，患者確診時大多處于中晚期，其5年生存率為15%～25%[2]。相反，早期確診食管鱗癌并接受手術治療的患者5年生存率接近90%[3]。微小RNA(miRNA)是一類單鏈、保守、20～24個核苷酸長度的非編碼小分子RNA。miRNA主要通過與靶基因mRNA的3′-非翻譯區(3′-UTR)非特異性結合，抑制其翻譯或調節降解以參與腫瘤的增殖、分化、遷移和凋亡[4]。Lawrie等[5]首次在B淋巴瘤患者外周循環血中發現miRNA穩定表達且能在早期被檢測出，其異常表達與腫瘤的診斷及預后相關。目前，已相繼有研究發現循環miRNA用于胃癌[6]、結直腸癌[7]、肝癌[8]、乳腺癌[9]及宮頸癌[10]的早期診斷，且其特異度及靈敏度均優于傳統血清診斷學標志物。已有研究證實，miR-424在子宮內膜癌及肝癌中發揮抑癌基因的作用[11]，且可作為宮頸癌[12]、肝癌[13]和非小細胞肺癌[14]的診斷標志物和預后因子。在食管鱗癌中，miR-424存在異常表達，并且可作用于下游靶位點，抑制腫瘤增殖[15]。在肝癌和結直腸癌患者血漿中可檢測到miR-92a異常表達，并且可作為診斷、預后的生物學指標[16]。在食管鱗癌中，miR-92a明顯高表達，參與腫瘤的發生發展并可作為預后因子指導后續治療[17]。此外，有研究發現，miR-130b表達均與食管鱗癌和肝癌的進展和預后密切相關[18]。盡管研究已證實miR-424、miR-92a及miR-130b與食管鱗癌的進展密切相關，但miR-424、miR-92a及miR-130b能否用于食管鱗癌早期診斷尚不清楚。2017年1月～2018年5月，我們檢測了食管鱗癌患者血漿miR-424、miR-92a及miR-130b水平，評估其在食管鱗癌中的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取成都醫學院第一附屬醫院胸心外科2017年1月～2018年5月收治的食管鱗癌患者43例。納入標準：①術前未采取包括放療、化療在內的任何治療；②術中均常規行淋巴結清掃術；③手術切除標本送病理檢查，最終術后病理檢查結果提示為食管鱗狀細胞癌。健康體檢者43例食管鱗癌患者中，男33例、女10例，年齡40～75(59.16±1.17)歲。根據美國癌癥聯合會(AJCC)與國際抗癌聯盟(UICC)共同制定的食管惡性腫瘤TNM標準進行臨床分期，Ⅰ期15例，Ⅱ期13例，Ⅲ、Ⅳ期15例。另選取同期體檢健康者43例，男26例、女17例，年齡42～73(57.92±0.93)歲。體檢健康者均未發現患有高血壓、糖尿病、心臟病及其他惡性腫瘤等病史。本研究經成都醫學院第一附屬醫院倫理委員會批準。研究對象均簽署知情同意書。

1.2 血漿miR-424、miR-92a及miR-130b表達檢測 食管鱗癌患者于入院次日采集清晨空腹肘正中靜脈血5 mL，健康體檢者于體檢當日采集空腹肘正中靜脈血5 mL，置于EDTA-K2抗凝真空采血管中，室溫放置1 h，于4 ℃，3 000 r/min離心10 min，取上清轉入1.5 mL RNase-free EP管中，于4 ℃、12 000 r/min離心20 min，取上清轉入1.5 mL RNase-free EP管中，置于-80 ℃深低溫冰箱中保存。根據北京TIANGEN公司提供的miRNA提取分離試劑盒進行血漿總RNA提取，使用超微量核酸蛋白測定儀(Thermo Scientific)檢測RNA純度，并采用電泳技術進行RNA定量分析。根據北京TIANGEN公司提供的miRcute增強型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒，冰上配置反應體系：Total RNA 5 μL，2×miRNA RT Reaction Buffer 10 μL，miRNA RT Enzyme Mix 2 μL，RNase-Free ddH2O 3 μL，按以下反應條件進行逆轉錄：42 ℃ 60 min，95 ℃ 3 min。通過miR Base數據庫查詢獲得基因序列，由四川生工科技有限公司合成提供引物(miR-424正向引物：5′-GAUACAGCAGCAAUUCAUGUUUUGAAGUGU-3′，miR-424反向引物：5′-CAGTGCGGTGTCGGTTGAGGT-3′；miR-92a正向引物：5′-GAUUGCACUAGUCCCGGCCUUC-3′，miR-92a反向引物：5′-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3′；miR-130b正向引物：5′-GACACUCUUUCCCUGUUGCACUACU-3′，miR-130b反向引物：5′-CGCAGTGCAATGATGAAAGG-3′；U6正向引物：5′-GTTTTGTAGTTTTTGGAGTTAGTGTTGTGT-3′，U6反向引物：5′-AACCGTTCTACCGATGTTGGT-3′)。根據北京TIANGEN公司miRcute增強型miRNA熒光定量檢測試劑盒，以上述合成的cDNA為模板，U6為內參，冰上配置10 μL反應體系：2×miRcute Plus miRNA Premix 5 μL，Forward Primer 0.25 μL，Reverse Primer 0.25 μL，miRNA第一鏈cDNA 0.5 μL，50×ROX Reference Dye 1 μL，ddH2O 3 μL，每項反應均設置3個復孔。反應條件：95 ℃ 15 min起始模板變性；94 ℃ 20 s，64 ℃ 30 s，72 ℃ 34 s，5個循環；94 ℃ 20 s，60 ℃ 34 s，45個循環退火、延伸；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s溶解曲線分析。計算不同樣品平均Ct值，以2-ΔCt法分析目的基因相對表達量，ΔCt食管鱗癌=Ct食管鱗癌-Ct內參，ΔCt對照組=Ct對照—Ct內參，2-ΔCt為食管鱗癌或健康人目的基因的表達量。

2 結果

2.1 食管鱗癌患者及體檢健康者血漿miR-424、miR-92a及miR-130b水平比較 食管鱗癌患者和體檢健康者血漿miR-424相對表達量分別為0.291 3±0.079 0、0.121 6±0.031 7，二者表達比較，P=0.001 2；食管鱗癌患者和體檢健康者血漿miR-92a相對表達量分別為4.698 0±0.462 8、1.571 0±0.092 8，二者表達比較，P<0.000 1；食管鱗癌患者和體檢健康者血漿miR-130b相對表達量分別為3.816 0±0.417 0、1.042 0±0.084 9，二者表達比較，P<0.000 1。

2.2 血漿miR-424、miR-92a及miR-130b水平與食管鱗癌患者臨床病理特征間的關系 見表1。

表1 血漿miR-424、miR-92a及miR-130b水平與食管鱗癌患者臨床病理特征間的關系

2.3 血漿miR-424、miR-92a及miR-130b在食管鱗癌中的診斷價值 制作的ROC曲線示，血漿miR-424用于食管鱗癌診斷對應的AUC為0.703(95%CI:0.595～0.797)，miR-92a對應的AUC為0.720(95%CI:0.613～0.812)，miR-130b對應的AUC為0.862(95%CI:0.771～0.927)；而血漿miR-424用于診斷食管鱗癌的特異度及靈敏度為72.09%和62.79%，血漿miR-92a對應的特異度及靈敏度為51.84%和88.37%，血漿miR-130b對應的特異度及靈敏度為90.70%和81.40%。

3 討論

臨床資料表明，對于早期食管鱗癌患者，術后5年和10年生存率明顯優于中晚期患者。然而，由于食管鱗癌患者缺乏早期特異的癥狀及體征，加上目前檢查手段的局限性，導致食管鱗癌患者預后欠佳。miRNA已被證實可同時存在于惡性腫瘤組織和血漿中，參與腫瘤的生物學進程且作為新的生物學指標指導后續診斷和治療[6～10]。循環miRNA較短，且具有莖環結構，從而具有耐受RNA酶的高度穩定性，其在血漿或血清中能穩定存在，加之其特異性和獨特的表達模式，因此可作為惡性腫瘤診斷的新型生物學標志物。本研究發現，食管鱗癌患者血漿miR-424、miR-92a及miR-130b表達均明顯高于健康人；血漿miR-92a、miR-130b表達均與食管鱗癌患者的腫瘤分級、淋巴結轉移和TNM分期相關；而低分化患者血漿miR-130b表達較高分化患者顯著上調。

miR-424在非小細胞肺癌中表達明顯增高，而過表達的miR-424通過作用于TNFAIP1的3′-UTR，促進腫瘤轉移[19]。在非小細胞肺癌中，miR-424表達越高的患者往往預后不良，生存期較miR-424低表達者明顯縮短，miR-424可作為非小細胞肺癌的預后因子[14]。在食管鱗癌中，miR-424表達明顯上調，而將其敲除可激活PRKCD及其下游p38 MAPK和JNK信號通路，增加p21蛋白的穩定性，調節細胞周期，抑制食管鱗癌發生發展[15]。本研究發現，在食管鱗癌患者血漿中，miR-424表達相對于健康人群明顯上調，但其與食管鱗癌腫瘤分級、分化、有無淋巴結轉移及腫瘤分期無統計學差異，用于診斷食管鱗癌的特異度及靈敏度僅為72.09%和62.79%，AUC為0.703。此前，血漿miR-424已被表明在肝癌中診斷的特異度和靈敏度分別為90.29%和95.12%[13]，明顯優于其單獨用于食管鱗癌中的診斷價值。因此，血漿miR-424有望聯合其他診斷學標志物，提高其用于診斷食管鱗癌的特異度和靈敏度。

MiR-92a屬于miR-17-92a簇，位于13號染色體長臂3區2帶至3區3帶之間(13q32-33)，其在眾多惡性腫瘤中是一個顯著擴增的區域。miR-92a表達在肝癌組織中明顯增高，實驗證實，miR-92a通過抑制FOXA2表達促進腫瘤的侵襲和轉移，從而發揮原癌基因的作用[20]。此外，miR-92a同樣存在于結直腸癌患者血循環中，并可作為結直腸癌患者預后的生物學標志物[16]。Chen等[21]發現，miR-92a在食管鱗癌組織中上調，并可通過作用于CDH1的3′-UTR，促進腫瘤細胞的侵襲和轉移。除此以外，miR-92a表達還可評估食管鱗癌患者的預后情況，可作為食管鱗癌患者預后的生物學指標。本研究證實，食管鱗癌患者血漿miR-92a表達高于健康人群，伴有淋巴結轉移的食管鱗癌患者血漿miR-92a表達較無淋巴結轉移患者明顯增高，且TNM Ⅲ+Ⅳ期的食管鱗癌患者的血漿miR-92a表達明顯高于TNM Ⅰ和Ⅱ期患者，miR-92a用于診斷食管鱗癌的特異度及靈敏度分別為51.84%和88.37%，AUC為0.720，明顯優于傳統的生物學標志物SCC-Ag(AUC=0.665)和CEA(AUC=0.549)[22]。此前，也尚未見血漿miR-92a單獨用于評價食管鱗癌診斷價值的相關報道，因此，血漿miR-92a有望作為早期篩查食管鱗癌的新的生物學標志物。但可能存在樣本量不足、檢測試劑及個體差異等問題，血漿miR-92a單獨用于食管鱗癌診斷的特異度尚未令人滿意。結合目前已有研究經驗，血漿miRNA聯合檢測可增加結直腸癌[24]、宮頸癌[25]診斷的特異度和靈敏度，彌補單個血漿miRNA所存在的局限性。因此，血漿miR-92a可結合其他血漿miRNA，提高其用于食管鱗癌的診斷價值。

本研究還檢測到血漿miR-130b表達在食管鱗癌患者中明顯上調，且與臨床病理特征間存在統計學差異，其中T4食管鱗癌患者血漿miR-130b表達均比T1、T2和T3患者增高，T3食管鱗癌患者血漿miR-130b表達與T1間同樣有統計學差異；有淋巴結轉移的食管鱗癌患者血漿miR-130b表達比無淋巴結轉移患者增高；與此同時，低分化患者血漿miR-130b表達較高分化患者上調；TNM Ⅲ+Ⅳ期的食管鱗癌患者血漿miR-130b表達高于TNM Ⅰ和Ⅱ期患者。血漿miR-130b診斷食管鱗癌所對應的AUC為0.862，特異度及靈敏度分別為90.70%和81.40%，相較于上述兩種指標，血漿miR-130b用于食管鱗癌診斷的特異度和靈敏度更高。已有研究證實，miR-130b通過結合PTEN mRNA的3′-UTR以降低PTEN蛋白表達，從而促進Akt磷酸化，最終導致食管鱗癌的發生發展。因此，血漿miR-130b在食管鱗癌的發生發展中起重要作用，并有望作為食管鱗癌診斷新的生物學標志物。

此次研究尚存在局限性。首先，研究樣本量相對較小；其次，血漿miR-424、miR-92a及miR-130b用于食管鱗癌診斷的特異度和靈敏度尚未令人十分滿意，若早期將血漿miRNA進行大范圍篩選并將常規生物標志物或其他miRNA組合可能更好。最后，未獲得足夠的數據進行生存分析，因此，血漿miR-424、miR-92a及miR-130b的預后價值未知，在后續研究中，我們將進行更長時間的隨訪調查，以評估其在食管鱗癌中的預后意義。

綜上所述，食管鱗癌患者血漿miR-424、miR-92a及miR-130b表達均明顯高于健康人，血漿miR-424、miR-92a及miR-130b可作為食管鱗癌診斷的新的生物學標志物。血漿miR-92a、130b異常表達可能與食管鱗癌進展密切相關。