胃癌組織中miR-200a-3p、G3BP2的表達及意義

李晶晶，王小云，武政喜，張寧，程玉娥，湯納，李睿

1石嘴山市第一人民醫院,寧夏石嘴山 753600;2寧夏醫科大學總醫院

胃癌是全球男性中第四大常見癌癥，在女性中排第五位，我國2012年發病約42萬例，死亡達29.8萬例[1]。近年來，隨著診斷及治療技術的發展，我國胃癌的病死率呈下降趨勢，但多數患者確診時已處于中晚期，同時伴有腫瘤局部侵襲和淋巴結轉移，5年總體生存率僅為30%左右[2]。微小RNA(miRNA)是內源性非編碼RNA，長度為20～24個核苷酸，能通過結合靶基因的3′端非編碼區(UTR)，影響靶基因的信使RNA穩定性，調控多條細胞內信號傳導通路，在炎癥、腫瘤、心血管等疾病中均發揮重要的調節作用[3]。miR-200a-3p位于人類染色體1p36.33，在腎細胞癌[4]、肝細胞肝癌[5]等腫瘤中異常表達，可通過影響靶基因CBL、CDK6等基因表達，影響腫瘤的發生發展。GTP酶激活蛋白SH3功能區結合蛋白2(G3BP2)基因位于人類染色體4q21.1，有17個外顯子。該基因編碼的G3BP2蛋白能與p53和E3泛素連接酶結合，促進p53的類泛素化，導致p53自細胞核移出[6]，削弱其抑癌作用，促進腫瘤細胞增殖。研究表明,多種miRNA，如miR23b等均可參與對G3BP2表達的調控過程，影響腫瘤的發生發展[7]。2015年1月～2019年1月，我們檢測了胃癌組織中miR-200a-3p及G3BP2表達，探討二者在胃癌發生發展中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年1月～2016年1月于我院接受手術治療的97例胃癌患者。納入標準：①均經術后病理檢查確診為胃腺癌；②首次診治，既往未接受過化療、放療等抗腫瘤治療；③臨床病理資料完整，患者或其家屬均知情同意并簽署知情同意書；④患者一般健康狀況良好，術后隨訪資料完整。排除標準：①合并其他胃惡性腫瘤(如平滑肌肉瘤等)，其他原發性惡性腫瘤，如原發性肝癌、腎癌等；②合并嚴重的心肝肺腎等臟器功能不全。其中男52例、女45例，年齡19～71(58.2±8.1)歲；伴淋巴結轉移50例，無淋巴結轉移47例；腫瘤直徑：<5 cm者63例，≥5 cm者34例；腫瘤位置：賁門胃底部、胃體部31例，幽門胃竇部66例；腫瘤TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期59例，Ⅲ、Ⅳ期38例；組織學分化程度：高中分化45例，低分化52例；浸潤深度：達深肌層及漿膜層62例，黏膜下層及淺肌層35例。

1.2 癌組織中miR-200a-3p及G3BP2表達的檢測方法 應用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測癌組織及其配對的癌旁正常組織(距腫瘤組織邊緣5 cm以上，且病理檢查未見腫瘤細胞)中miR-200a-3p及G3BP2mRNA的表達。取約50 mg組織，液氮中研磨，加入1 mL TRIzol充分裂解細胞，嚴格按照試劑盒說明書操作步驟提取組織中總RNA，溶于DEPC水中，紫外分光光度計檢測總RNA的濃度及純度，OD260/OD280介于1.9～2.1。以總RNA為模板，應用逆轉錄試劑盒進行對總RNA反轉錄，合成cDNA。按照BIOMIGA公司SYBR Green試劑盒說明書配制qRT-PCR反應體系。miR-200a-3p特異性莖環引物正向引物：5′-ACTCAACGTGCAAGCCTCG-3′，反向引物：5′-GCTCAAGAAAGTGCTGATCCC-3′，miR-200a-3p的內參U6正向引物:5′-ACCAGGACCAGAGGAAACCT-3′，反向引物:5′-GCTAGCCTCTGGATT-3′；G3BP2正向引物:5′-GTAGGGCGGGAGTTTGTGAG-3′，反向引物:5′-CTGGGGCTTTCCACTAGCATC-3′，G3BP2的內參基因GAPDH正向引物:5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′，反向引物:3′-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-5′。反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，變性、退火及延伸過程共40個循環。每個樣本設3個復孔。采用相對Ct值方法進行數據分析，miR-200a-3p及G3BP2的相對表達量以2-ΔCt法表示，其中ΔCt=CtmiR-200a-3p/G3BP2-CtGAPDH。

1.3 隨訪 以門診或電話方式對患者進行隨訪，隨訪起始時間為手術日起，每3個月隨訪1次，隨訪終止時間為2019年1月。隨訪終點為患者死亡或隨訪結束。統計患者復發及生存情況。

2 結果

2.1 胃癌組織與癌旁正常組織中miR-200a-3p及G3BP2表達比較 胃癌組織與癌旁正常組織中miR-200a-3p相對表達量分別為0.375±0.082、1.106±0.122，G3BP2相對表達量分別為3.757±0.930、1.041±0.345。胃癌組織中miR-200a-3p相對表達量低于癌旁正常組織(t=48.977，P=0.000)，而G3BP2相對表達量高于癌旁正常組織(t=26.967，P=0.000)。

2.2 胃癌組織中miR-200a-3p、G3BP2表達與患者臨床病理特征的關系 癌組織中miR-200a-3p、G3BP2表達與腫瘤TNM分期及組織分化程度有關(P均<0.05)，而與患者年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤位置及淋巴結轉移無關(P均>0.05)。見表1。

表1 胃癌組織中miR-200a-3p、G3BP2表達與患者臨床病理特征的關系

2.3 胃癌組織中miR-200a-3p與G3BP2表達的關系 Pearson線性相關分析顯示，胃癌組織中miR-200a-3p與G3BP2表達呈負相關(r=-0.610，P=0.008)。

2.4 胃癌組織中不同miR-200a-3p、G3BP2表達與生存預后的關系 截至2019年1月，所有患者隨訪2～36個月，中位隨訪時間25.3個月。隨訪過程中無失訪病例，隨訪期間死亡37例，17例為術后出現腫瘤復發轉移，20例為腫瘤進展死亡。以miR-200a-3p相對表達量的平均數0.375為界值，其中miR-200a-3p高表達組47例，miR-200a-3p低表達組50例。miR-200a-3p高表達組3年總體生存率(OS)為80.9%(38/47)，miR-200a-3p低表達組3年OS為44.0%(22/50)。Kaplan-Meier生存分析結果顯示，miR-200a-3p低表達組患者3年OS低于miR-200a-3p高表達組(χ2=13.994，P=0.002)。以G3BP2相對表達量的平均數3.757為臨界值，其中G3BP2高表達組48例，G3BP2低表達組49例。G3BP2高表達組3年OS為52.1%(25/48)，G3BP2低表達組3年OS為71.4%(35/49)，Kaplan-Meier生存分析結果顯示，G3BP2高表達組3年OS低于G3BP2低表達組(χ2=4.047，P=0.044)。

3 討論

我國是胃癌發病率較高的國家之一，發病和死亡例數約占全球病例數的50%[8]。早期胃癌局限于黏膜層或黏膜下層，淋巴結轉移率低，手術治療預后較好，5年存活率達90%以上。胃癌早期臨床癥狀不典型，多數患者就診時已為中晚期，單純手術治療效果差，常需放化療、靶向治療及免疫治療等多學科綜合性治療，但治療有效率低，患者生存預后較差[9]。

miRNA是長度20～25個核苷酸的非編碼RNA分子，在腫瘤發生發展過程中，miRNA能調控腫瘤細胞的細胞周期、細胞凋亡、侵襲、轉移及耐藥性的產生等，有可能成為腫瘤診斷、治療及預后的生物學靶點[10]。miRNA具有腫瘤促進和腫瘤抑制兩種功能，miRNA能通過結合靶基因信使RNA 5′端結合，改變信使RNA的穩定性，調控基因表達。近年來，在肝癌、腎癌等腫瘤中均發現miR-200a-3p表達降低的現象，并能通過調控反向靶基因的表達，促進腫瘤的惡性進展。如在腎細胞癌中miR-200a-3p能通過靶向抑制癌基因精子相關抗原9的表達，抑制腫瘤細胞的增殖，并誘導細胞凋亡，發揮腫瘤抑制功能[11]。本研究結果顯示，胃癌組織中miR-200a-3p的相對表達量低于癌旁正常組織，差異有統計學意義，原因可能是長鏈非編碼RNA，如小核仁RNA宿主基因15(SNHG15)作為內源競爭性RNA，競爭性抑制miR-200a-3p表達及功能，促進反向Yes相關蛋白1(YAP1)-Hippo信號通路活化，導致腫瘤進展[12]。此外，胃癌組織中miR-200a-3p表達與腫瘤TNM分期、組織分化有關，表明癌組織中miR-200a-3p表達參與腫瘤的發生發展。其機制可能是miR-200a-3p能通過結合并抑制上皮間質轉化相關基因的表達，如E-鈣黏蛋白、轉錄因子ZEB1和ZEB2等，抑制上皮表型向間質表型轉化。本研究結果顯示，miR-200a-3p低表達組3年OS低于miR-200a-3p高表達組，表明miR-200a-3p可提示患者預后。

G3BP2是RNA結合蛋白家族的成員，參與特異性信使RNA的穩定和降解，調控靶基因的翻譯過程，參與病毒感染、細胞應激調節及腫瘤惡性進展等過程的調控[13]。近年來研究表明，G3BP2在乳腺癌[14]、前列腺癌[15]等腫瘤中存在表達升高的現象。本研究中，胃癌組織中G3BP2的相對表達量高于癌旁組織，其機制可能與抑制其表達的miRNA,如miR-1178表達降低有關。正常狀態時，miR-1178通過結合G3BP2的UTR，促進信使RNA降解，而在腫瘤發生后，miR-1178表達降低，導致G3BP2表達顯著升高[16]。此外，低分化、腫瘤分期Ⅲ、Ⅳ期癌組織中G3BP2表達較高，表明癌組織中G3BP2表達可能參與胃癌的發生發展。其原因可能是腫瘤發生時，α-細小蛋白表達降低，G3BP2能直接結合并活化上皮間質轉化關鍵轉錄因子Twist，促進反向信號傳導，促進腫瘤細胞的惡性增殖及向上皮表型轉化[17]。此外，本研究中，G3BP2高表達組3年OS較G3BP2低表達組低，表明G3BP2能提示胃癌患者預后。本研究結果顯示，胃癌組織中G3BP2與miR-200a-3p表達呈負相關關系，其機制目前尚不清楚，可能是miR-200a-3p能結合上皮間質轉化的關鍵轉錄因子，如ZEB1、TWIST等的啟動子區，抑制轉錄因子表達[18]。

綜上所述，胃癌組織中G3BP2表達升高，而miR-200a-3p表達降低，二者聯合檢測有助于患者病情判斷及預后評估。