MTHFR基因多態性與急性淋巴細胞白血病患兒甲氨蝶呤化療后不良反應及臨床預后的關系

鄭明霞,趙文理

1蘇州大學醫學部兒科臨床醫學院，江蘇蘇州 215000;2蘇州大學附屬兒童醫院;3上海交通大學附屬第六人民醫院南院

急性淋巴細胞性白血病(ALL)是小兒最常見的惡性腫瘤之一，占兒童白血病的70%～80%，是導致兒童死亡的主要原因[1]之一。近年來，隨著ALL分子生物學的分型、新的化療藥物及化療方案的不斷發展，小兒ALL的救治成功率提高，完全緩解率達90%以上[2]。大劑量甲氨蝶呤(MTX)化療是目前治療小兒ALL的主要方案之一，但在臨床用藥過程中發現，不同患兒用藥后臨床反應及不良反應差異較大[3]，因而有必要針對藥物代謝相關的基因，對患兒用藥后不良反應進行預測，以指導臨床合理用藥。亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)是葉酸和蛋氨酸代謝過程中的限速酶，而葉酸參與DNA的合成、修復及甲基化等過程。MTHFR基因C677T和A1298C位點突變導致酶活性下降，細胞內葉酸水平和S-腺苷甲硫氨酸(SAM)降低，DNA中的胞嘧啶甲基化水平降低后促進原癌基因啟動子過度激活并誘導細胞惡性轉化[4]。此外，研究表明MTHFR基因多態性影響大劑量MTX化療的敏感性和特異性，并與大劑量MTX化療的不良反應和預后有關[5]。2016年3月～2017年3月，我們通過檢測ALL患兒MTHFR基因C677T和A1298C位點多態性，研究其與大劑量MTX化療不良反應和臨床預后的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年3月～2017年3月蘇州大學附屬兒童醫院診治的112例ALL患兒，其中男59例、女53例，年齡(6.2±2.4)歲。滿足CCLG-ALL2008危險分型標準[6]，其中標危51例，中高危61例。納入標準：①ALL的診斷符合中華醫學會兒科分會血液學組制定的《兒童急性淋巴細胞白血病診療建議(第四次修訂)》[7]；②均為初次診治，既往未接受過化療等治療；③至少完成一周期的大劑量MTX化療。排除標準：①臨床病理及隨訪資料不完整；②未接受大劑量MTX化療；③治療前均無嚴重肝腎功能障礙

1.2 治療方法 患兒均予大劑量MTX化療，化療劑量標危2 g/m2，中危及高危5 g/m2。24 h滴注MTX，突擊量給藥：將總劑量的10% 30 min內靜脈快速滴注；均勻量給藥：總劑量剩余90%在23.5 h內勻速靜脈滴注，同時予以碳酸氫鈉注射液堿化水化，及保護肝腎功能等輔助治療。化療后48 h監測血MTX藥物濃度，36 h后予以亞葉酸鈣解救治療(15 mg/m2)，6 h一次，根據MTX藥物濃度決定給藥次數，共6～8次，至血藥濃度<0.1 μmol/L。

1.3 基因檢測方法 患兒大劑量MTX治療前，抽取空腹外周靜脈血3 mL，枸櫞酸鈉抗凝，應用DNA提取試劑盒提取基因組DNA，應用瓊脂糖凝膠電泳進一步確定DNA的完整性，-20 ℃冰箱保存。應用熒光定量PCR法對MTHRF基因C677T和A1298C位點進行單核苷酸多態性分析，C677T正向引物序列：5′-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3′，逆向引物序列：5′-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3′；A1298C正向引物序列：5′-CTTTGGGGAGGTGAAGGACTACTAC-3′，逆向引物序列：5′-CTTTGGGGAGGTGAAGGACTACTAC-3′。反應條件：95 ℃ 5 min、95 ℃ 30 s、60 ℃ 60 s、72 ℃ 60 s、72 ℃ 5 min，共40個循環。用限制性核酸內切酶對PCR產物進行限制性消化，總體系20 μL，其中12 μL PCR產物，2 μL 10×緩沖液B，2 μL 1 g/L乙酰化BSA，0.5 μL HinfⅠ限制性核酸內切酶，去離子水定容至20 μL。制備聚丙烯凝膠，取10 μL樣品，2 μL的loading buffer 80 V電泳1 h，銀染后干膠攝片。C677T野生型CC為198 bp單片段，TT型為23 bp，175 bp兩個片段，CT型為23、175、198 bp三個片段。A1298C野生型AA為29、37、79 bp三個片段，CC型為37、108 bp兩個片段，AC型為29、37、79、108 bp四個片段。

1.4 隨訪 所有患兒自出院之日起開始隨訪，隨訪時間1～35個月，中位隨訪時間26個月，隨訪間隔時間1～3個月，以門診或電話方式隨訪，收集患兒化療期間胃腸道反應、皮膚黏膜損傷等不良反應，化療后血常規、肝腎功能等指標變化，復發情況、生存時間，計算各基因型患兒不良反應發生率、復發率及無事件生存期(EFI)。EFI為從確診至事件發生或隨訪終止，事件定義為患兒誘導化療失敗、嚴重感染或死亡。復發指骨髓復發(骨髓原始+幼稚細胞≥25%)和(或)髓外復發如中樞神經系統復發(有相應的癥狀、體征，腦脊液有明確的白血病細胞且白細胞≥5×106/L)或睪丸復發(病理活檢證實有白血病細胞浸潤)。隨訪終點為2019年3月，無失訪病例。

2 結果

2.1 ALL患兒MTHFR基因型分布 MTHFR基因 C677T位點中，野生型CC占34.8%(39/112)，TT突變型占20.5%(23/112)，CT突變型占44.6%(50/112)，以CT突變型最常見；MTHFR基因A1298C位點中，野生型AA占53.6%(60/112)，AC突變型占34.8%(39/112)，CC突變型占11.6%(13/112)，以野生型AA最常見。

2.2 大劑量MTX化療與不良反應的關系 本研究中，大劑量MTX化療后的主要不良反應中，胃腸道反應(如惡心、嘔吐等)占56.3%(63/112)，骨髓抑制占69.6%(78/112)，皮膚黏膜損傷(如口腔黏膜炎、皮疹等)占45.5%(51/112)，肝腎功能損傷占16.1%(18/112)。MTHFR C677T各基因型在胃腸道反應、骨髓抑制、皮膚黏膜損傷及肝腎功能損害間差異無統計學意義(P均>0.05)，見表1。MTHFR A1298C各基因型在胃腸道反應間差異有統計學意義(P<0.05)，而在骨髓抑制、皮膚黏膜損傷及肝腎功能損害間差異無統計學意義(P均>0.05)，見表2。

表1 MTHFR C677T基因型對MTX化療與不良反應關系

表2 MTHFR A1298C基因型對MTX化療與不良反應關系

2.3 ALL患兒MTHFR C677T基因型與預后的關系 MTHFR C677T的CC、CT、TT基因型患兒復發率分別為7.7%(7/39)、15.0%(10/50)，17.9%(2/23)，TT型患兒復發率明顯高于CC、CT型患兒(χ2分別為0.392、0.758，P分別為0.531、0.384)。CC、CT、TT基因型EFI分別為(25.59±7.64)、(22.61±7.64)、(17.90±7.62)個月，TT型ALL患兒EFI較CC型、CT型EFI長(t分別為3.534、2.322,P分別為0.001、0.023)，而CC型與CT型EFI間差異無統計學意義(t=1.721,P=0.089)。

2.4 ALL患兒MTHFR A1298C基因型與預后的關系 MTHFR A1298C的CC、AA、AC各基因型患兒復發率分別為15.4%(2/13)、18.3%(11/60)、15.4%(6/39)，各基因型患兒復發率間差異無統計學意義(χ2=0.173，P=0.917)。CC、AA、AC各基因型EFI分別為(25.23±8.35)、(20.29±7.71)、(19.90±7.02)個月，各基因型患兒EFI之間差異無統計學意義(F=3.03，P=0.052)。

3 討論

小兒ALL是骨髓造血干細胞的惡性增殖性疾病。遺傳因素與環境因素共同參與腫瘤的發生發展，環境因素可促進疾病發展，而基因的遺傳易感性和對環境的反應性決定了白血病發生的風險[8]。近年來，隨著新的ALL化療藥物的應用和治療方案改進，提高了患兒的長期無病生存時間[9]。大劑量MTX化療是小兒ALL治療的重要化療方案，對于誘導患兒持續緩解和預防ALL復發有重要意義。但臨床治療過程中，不同個體用藥后的療效和藥物毒性反應不一，其原因是葉酸代謝調節基因的單核苷酸多態性對MTX的藥物代謝動力學影響。此外，葉酸提供1-碳單位用于正常DNA合成和甲基化，對于細胞發揮其功能是必需的。MTHFR主要在體內促進5,10-亞甲基四氫葉酸生成5-甲基四氫葉酸，參與體內葉酸代謝。葉酸代謝相關酶的基因多態性，如MTHFR、二甲基四氫葉酸還原酶等基因，可下調葉酸水平或改變細胞中葉酸的分布，從而影響葉酸代謝，干擾DNA合成和甲基化，影響DNA合成和修復，增加患惡性腫瘤的風險[10]。本研究中，我們應用PCR-RFLP法分析ALL患兒的MTHFR基因兩個常見的突變位點，即第677位的C-T突變和第1298位的A-C突變，探討MTHFR基因多態性的分布及各基因型與大劑量MTX化療不良反應和臨床預后的關系。

本研究中，MTHFR C677T基因型中，CC型、TT型及CT型占比分別為34.8%、20.5%、44.6%，其中CT型最常見，與以往報道一致[11]。C677T的多態性發生在外顯子4上，導致第222密碼子處的丙氨酸被纈氨酸取代，導致MTHFR與其輔助因子黃素腺嘌呤二核苷酸結合力降低，葉酸水平降低，而同型半胱氨酸水平升高。研究表明，MTHFR C677T TT基因型與CC野生型相比，MTHFR酶活性僅為30%，而突變雜合子CT基因型的酶活性為CC野生型的60%[12]。本研究結果顯示，ALL患兒C677T各基因型大劑量MTX化療后不良反應間差異無統計學意義，但TT型患兒復發率低于CC、CT型患兒，TT型患兒EFI較CC型、CT型EFI長，表明C677T TT突變型對ALL具有保護性作用，與以往研究報道一致[13]，其機制可能是C677T TT突變型通過分流一碳單位，促進細胞內胸苷和嘌呤合成，通過環狀途徑增加細胞內葉酸水平，增加大劑量MTX化療細胞毒性，提高藥物治療的敏感性，從而降低ALL患兒復發率，延長患兒無事件生存時間[14]。本研究中，MTHFR A1298C基因型中，AA型、AC型、CC型分別為占53.5%、34.8%、11.6%，以AA型最常見。A1298C的多態性位于第7外顯子中，導致第429位密碼子谷氨酸被丙氨酸替代，這種多態性存在于MTHFR的S-腺苷甲硫氨酸(SAM)調節結構域中，結果導致與SAM結合后MTHFR酶構象發生改變，MTHFR酶活性受到抑制。研究表明，淋巴細胞中CC型的MTHFR酶活性僅為野生型AA型的60%，而AC型的酶活性為野生型的50%～60%[15]。ALL患兒大劑量MTX治療后A1298C突變型CC型和AC型的消化系統不良反應發生率明顯高于野生型AA型，表明與A1298C 野生型AA相比，CC和AC突變型MTX化療后不易發生毒性反應，與以往報道一致[16]。表明CC和AC突變型可能是大劑量MTX化療不良反應的保護因素。其原因是MTHFR酶活性降低導致5,10-亞甲基四氫葉酸增多，促進胸腺嘧啶的合成，進而起到對抗MTX的細胞毒性作用[17]。此外，本研究中A1298C CC、AA、AC型間復發率和EFI差異無統計學意義，可能與樣本例數有限有關，有待進一步深入研究。

綜上所述，MTHFR C677T基因多態性與ALLA患兒大劑量MTX治療后毒性反應無關，TT型患兒復發率較CC型、CT型低，而EFI明顯較長，MTHFR A1298C基因多態性與消化道不良反應有關，各基因型間復發率和EFI差異無統計學意義。檢測ALL患兒MTHFR C677T、A1298C基因多態性有助于指導個體化治療。