草莓果生刺盤孢菌候選效應子的生物信息學及功能分析

何成勇，張麗勍，高清華，段 可*

(1上海海洋大學食品學院，上海 201306；2上海市農業科學院林木果樹研究所，上海市設施園藝技術重點實驗室，上海 201403)

植物通過表面的跨膜識別受體識別病原物相關分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)產生的免疫稱為病原物相關分子激發的免疫(PAMPs-triggered immunity，PTI)。病原物為了打破植物的PTI防御系統，逐漸進化出一種攻擊武器—效應子[1]。效應子通常是由病原微生物如細菌、卵菌、真菌等分泌的小分子物質及次級代謝產物[2-5]。當效應子被病原物分泌至寄主細胞后，其中一部分停留在寄主細胞質外體，并在質外體發揮相應的作用，這類效應子被稱為胞外效應子；另一部分能跨越寄主細胞膜進入細胞質內并與相應的胞內靶標互作，這類效應子被稱為胞內效應子。大多數的效應子都屬于胞內效應子，可以被富含亮氨酸的重復序列和核苷酸結合位點(Nucleotide binding site-leucine rich repeat，NBS-LRR)抗性蛋白受體所識別[6]。效應子依據其功能不同可以分為兩類：一類是通過抑制寄主的抗性反應從而促進病原物的侵染，稱為效應子誘發的感病性(Effector-triggered susceptibility，ETS)；另一類則能夠直接或間接被寄主植物識別，導致寄主產生效應子觸發的免疫反應(Effector-triggered immunity，ETI)[7]。真菌類生物或真菌本身可能有成百上千種分泌蛋白，但只要該蛋白可以進入寄主體內并通過影響寄主植物的生理反應或者干擾寄主植物的免疫防衛反應，即是效應子。因此，有無信號肽成為效應子評判的重要指標[8]。

草莓炭疽病(Strawberry anthracnose)是影響我國乃至全球草莓產業發展的重大病害，在草莓生長發育的各個階段均可發病，危害草莓葉片、匍匐莖、根冠等部位，可造成嚴重的經濟損失[9-10]。炭疽菌有多個小種，不同小種在草莓上的病癥極為相似，但侵染位點和侵染力存在明顯差異[11]。我國草莓炭疽病主要在南方長江中下游溫暖濕潤地區發生[12-14]，引起該病害的炭疽菌菌株主要是果生刺盤孢菌(Colletotrichumfructicola)，果生刺盤孢菌全基因組信息的公布[15]，極大地促進了果生刺盤孢菌-草莓的互作研究工作。

目前，國內對果生刺盤孢菌的研究主要集中于病原菌的鑒定及其生物特性分析，而針對果生刺盤孢菌效應子的研究鮮有報道。本研究利用生物信息學手段并結合轉錄組分析結果，預測果生刺盤孢菌效應子，并分析其功能，以期為進一步研究果生刺盤孢菌奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

‘久香’草莓，為上海市農業科學院林木果樹研究所草莓課題組自主育成品種，種植于上海市農業科學院設施園藝技術重點實驗室溫室大棚。本氏煙種子、果生刺盤孢菌菌株、農桿菌GV3101菌株及大腸桿菌DH5α菌株為本實驗室保存，瞬時表達載體PGD由中國農業科學院植物保護研究所張昊副研究員惠贈。

RNA提取試劑盒購于北京原平皓生物技術有限公司；pEASY-T1 Simple Cloning Vector載體、高保真DNA聚合酶購于北京全式金生物技術有限公司；T4 DNA連接酶購于Fermentas公司(加拿大)；質粒小量提取試劑盒、DNA純化試劑盒購于Axygen公司(美國)；氨芐青霉素(Amp)、慶大霉素(Gen)、利福平(Rifampicin，Rif)、卡那霉素(Kan)購于上海生工生物有限公司；RT-PCR反轉錄試劑盒、DL2000 DNA Marker購于寶生物工程(大連)有限公司；效應子擴增引物由上海生工生物有限公司合成(表1)。

表1 候選效應子擴增引物

1.2 方法

1.2.1 候選效應子的生物信息學分析

1.2.2 候選效應子的轉錄分析

2017年1月將栽培草莓品種‘久香’組培苗移種人工氣候室，6個月后，選取36株有8—10片復葉的健壯植株，每12株為1個重復，噴霧法接種C.fructicola分生孢子懸浮液。覆膜后移至光照培養箱，培養條件為：光培養暗培養時間為12 h12 h，光通量密度為125 μmol(m2·s)，相對濕度為70%，溫度為25℃。于附著胞形成階段(Planta appressoria，PA)、活體營養階段(Biotrophic phase，BP)、死體營養階段(Necrotrophic phase，NP)分別取樣，提取葉片RNA，根據Takara反轉錄試劑盒說明書合成第一條cDNA鏈。PCR反應體系：cDNA 2 μL，10×buffer 5 μL，dNTP(2.5 mmolL)2 μL，高保真Taq酶0.5 μL，上、下游引物(10 μmolL)各1 μL，ddH2O補至50 μL，充分混勻。PCR反應程序：94℃ 2 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 2 min，30次循環；72℃ 10 min；4℃保存。使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收純化PCR產物，純化產物送鉑尚生物技術(上海)有限公司測序鑒定。

1.2.3 候選效應子基因克隆

將測序驗證的回收產物連接至克隆載體pEASY-T1 Simple Cloning Vector，連接產物轉入大腸桿菌DH5α感受態細胞后于37 ℃倒置避光培養12 h。挑取單克隆，測序驗證陽性克隆。

1.2.4 農桿菌介導的煙草瞬時表達

將克隆得到的效應子基因構建至瞬時表達載體PGD，重組質粒由鉑尚生物技術(上海)有限公司測序鑒定。重組質粒采用凍融法轉化農桿菌GV3101感受態，涂板，挑取單克隆，PCR法檢測陽性克隆。

重組載體、Bax、P19、空載的陽性單克隆于5 mL LB液體培養基中[Kan：50 μL+Rif：50 μL+(0.2 molL)MES：1 mL+(100 mgmL)AS：20 μL]、28℃、200 rmin、搖床培養24 h；離心富集菌體，加入2 mL懸浮液[50 mL ddH2O+(1 molL)MgCl2：500 μL+(100mmolL)As：100 μL+(0.2 molL，pH 5.7)MES：2.5 mL]，渦旋混勻。調節菌液OD600值：P19=0.2，空載=0.4，重組載體=0.4，Bax=0.4?？蛰d、效應子、Bax分別與P19菌液1∶1混合，暗處理2 h。選取合適的煙草葉片注射混合菌液，4—5 d后觀察效應子誘導或抑制細胞凋亡的反應，拍照并記錄。

2 結果與分析

2.1 草莓果生刺盤孢菌候選效應子Pfam分析

草莓果生刺盤孢菌3個候選效應子蛋白中，候選蛋白CGGC5_4 515.1和CGGC5_7 542.1不具有典型的結構域，不屬于任何一個蛋白家族。CGGC5_8 825.1第36—266位核苷酸具有過氧化物酶類家族結構域，屬于過氧化物酶類家族(表2)。

表2 草莓果生刺盤孢菌候選效應子蛋白Pfam分析

注：E值<0.001，結果可靠

2.2 草莓果生刺盤孢菌候選效應子信號肽分析

由表3可知，3個候選效應子都具有信號肽。其中，CGGC5_4 515.1 N端第1—24位氨基酸為其信號肽所在位置，其余2個候選效應子的N端第1—18位氨基酸為其信號肽所在位置。

表3 草莓果生刺盤孢菌候選效應子蛋白信號肽分析

注：+表示具有信號肽，1—18或1—24表示該信號肽為效應子第1—18或1—24位氨基酸，2425和1819表示該效應子第25位氨基酸和第19位氨基酸之前為信號肽序列

2.3 草莓果生刺盤孢菌候選效應子亞細胞定位分析

由表4可知，3個候選效應子蛋白通過分泌途徑分泌至胞外的得分值均≥0.400，且定位預測可信度較高(RC=1)，結果較為可靠。因此，初步認為3個候選效應子蛋白均為分泌蛋白，可通過草莓果生刺盤孢菌分泌途徑分泌至胞外。

表4 草莓果生刺盤孢菌候選效應子亞細胞定位分析

注：mTP：線粒體定位；SP：分泌蛋白，有信號肽；Other：定位于其他細胞結構；Loc：預測定位結果；S：分泌途徑。RC：可信度等級為1—5，RC值越低，定位越準確

2.4 草莓果生刺盤孢菌候選效應子跨膜結構域預測

3個候選效應子蛋白均不含有跨膜結構域，表明這3個候選效應子均屬于分泌蛋白。

2.5 草莓果生刺盤孢菌候選效應子系統進化樹構建

由圖1可知，C.orbiulare，C.fioriniae，C.nymphaeae，C.salicis，C.tofieldiae，C.incanum，C.higginsianum，C.sublineola和C.graminicola為同一分支；C.fructicola單獨成一分支。C.tofieldiae，C.incanum，C.higginsianum，C.sublineola和C.graminicola同源性較高；C.fioriniae，C.nymphaeae，C.salicis同源性較高，而C.orbiulare則與分支一種其他菌株同源性較低，被獨立分到另一小分支。

2.6 草莓果生刺盤孢菌候選效應子轉錄組學分析

轉錄組測序結果表明，盡管這3個候選效應子在果生刺盤孢菌侵染的不同階段均上調表達，但表達程度有較大差異(圖2)，說明這些蛋白可能在果生刺盤孢菌侵染過程中發揮不同的作用。RT-PCR結果表明，3個候選效應子在侵染的3個階段均有表達，預測這3個候選效應子均為果生刺盤孢菌效應子。

2.7 農桿菌介導的煙草瞬時表達

由圖3可知，CGGC5_4515、CGGC5_7542、CGGC5_8825分別與Bax共同注射煙草時均能抑制由Bax基因誘導的煙草細胞的凋亡。

3 結論與討論

盡管活體營養和死體營養型真菌調控寄主植物細胞的機制已較清楚，但半活體營養型真菌對植物的調控機制尚不明確[16]?；铙w營養型真菌為了與植物建立緊密的聯系，通過吸器或菌絲從植物中吸取營養[17]，死體營養型真菌則分泌一些特殊的酶或者毒性因子將寄主植物細胞殺死，并從死亡的植物中吸取營養[18]，半活體營養型真菌則具有活體營養型和死體營養型真菌調控機制的雙重特征。研究表明：植物病原真菌能夠在侵染過程中分泌效應子。這些效應子在病原真菌致病的過程中與寄主植物互作并發揮重要作用[19]。效應子通常具有疏水的N末端信號肽，這主要是由于效應子多數是經內質網或高爾基體分泌[20]。隨著高通量測序技術的出現，效應子已逐漸成為抗性基因篩選和新品種輔助選育的工具，效應子組學極大的促進了傳統的抗性育種，成為一種更高效的育種方法。本研究利用生物信息學手段并結合轉錄分析結果，對初步獲得的3個果生刺盤孢菌候選基因進行蛋白家族和跨膜結構域預測、信號肽分析和亞細胞定位分析，結果表明，3個候選基因均為果生刺盤孢菌的效應子。

HR反應是植物對入侵病原物產生的一種快速、激烈的應答反應，常常伴隨著病原物入侵位點細胞的死亡[21]。Carney等[22]通過葉片接種青枯菌，認為不親和的菌株在接種后24—30 h可在植物上激發明顯的HR反應。Nahar等[23]研究發現效應蛋白RipAX1能夠在茄子葉片上誘導特異性的HR反應。趙郭珍[24]利用農桿菌介導的瞬時表達系統在本氏煙及7種煙草上鑒定發現,效應子Rip5可在所有的測試植物上誘導葉片組織的HR反應。本研究中的3個候選效應子均能抑制Bax誘導的細胞凋亡。該類效應子可能在果生刺盤孢菌入侵草莓的活體營養階段發揮作用，通過抑制草莓植株產生的HR反應，從而逃避寄主對果生刺盤孢菌的抑制，達到成功侵染的目的。