豬Delta冠狀病毒的流行病學調查及M基因序列分析

馬玉飛，李本強，陶 潔，程靖華，劉 雷，劉惠莉*

(1上海市農業科學院畜牧獸醫研究所，上海種豬工程技術研究中心，上海 201106；2 上海海洋大學水產科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306)

豬Delta冠狀病毒(Porcine deltacoronavirus，PDCoV)屬于冠狀病毒科(Coronaviridae)、δ-冠狀病毒屬(Deltacoronavirus)，是一種新發現的單股正鏈RNA病毒，主要感染小腸，尤其是空腸末端和回腸，可引起嚴重的腸炎并伴有腹瀉、脫水等癥狀，臨床特征與豬流行性腹瀉(PED)和豬傳染性胃腸炎(TGE)相似，但該病毒可致哺乳期仔豬產生較高死亡率，給養殖業帶來嚴重的經濟損失。Ma等[1]將分離到的PDCoV病毒接種新生仔豬，所有接種豬只均發生水樣腹瀉、嘔吐等流行性腹瀉樣癥狀。

PDCoV基因組全長大約25 kb，是所有冠狀病毒中基因組最小的，其基因組成、排列與其他冠狀病毒相似，包括5’和3’非翻譯區以及7個開放閱讀框，編碼4 種主要的結構蛋白：纖突(S)蛋白、囊膜(E)蛋白、膜(M)蛋白和核衣殼(N)蛋白。研究表明，PDCoV 的M基因在不同毒株之間的同源性大于90%，與其他冠狀病毒M基因的同源性均小于50%[2]。PDCoV作為豬病毒性腹瀉的新病原，逐漸受到了關注，繼美國成功分離到2株PDCoV之后[3]，陳建飛等[4]成功分離到了國內首株PDCoV。但因很多腹瀉類病毒都主要感染小腸部位，運用傳統方法中的臨床剖檢和顯微鏡觀察很難將PDCoV與其他豬腹瀉病毒加以區分。本研究以PDCoV保守的M基因為擴增目的片段，建立RT-PCR檢測方法，并對臨床PDCoV感染情況進行監測分析，為了解PDCoV在豬腹瀉疫病中的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品與病毒

2015—2017年從上海及周邊豬場采集518份有腹瀉癥狀豬的糞便樣品。

豬流感病毒(SIV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬輪狀病毒(PoRV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)及大腸桿菌(E.coli)由本實驗室保存。

1.2 主要試劑

M-MLV RNA聚合酶、rTaq DNA 聚合酶、500 bp DNA Maker、pMD-18T載體等PCR試劑均購自TaKaRa公司(日本)；DH5α感受態細胞由本實驗室提供。質粒提取試劑盒及膠回收試劑盒均購自天根生化科技有限公司。

1.3 引物設計

根據GenBank中已發表PDCoV 毒株的M基因序列，應用DNASTAR和Oligo 7軟件針對M基因保守序列區域設計1對特異性引物，此外，根據參考文獻[5-6]，設計并合成豬嵴病毒(PKV)、豬星狀病毒(PAstV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TEGV)的檢測引物(表1)。引物由鉑尚生物技術(上海)有限公司合成。

表1 引物序列

1.4 臨床樣品的處理與總RNA的提取

將糞便樣品用PBS按照1∶5比例稀釋，震蕩混勻，靜置10 min，取250 μL上清液與750 μL Trizol裂解液，震蕩混合，冰浴靜置10 min；加入200 μL三氯甲烷，震蕩混勻，冰浴靜置5 min，4 ℃ 12 000 rmin離心15 min；吸取上清，加入等體積的異丙醇，-20 ℃沉淀15 min；4℃ 12 000 rmin離心15 min；棄上清，加入1 mL 75%乙醇洗滌；4℃ 12 000 rmin離心15 min，棄上清并吹干；用20 μL無RNase DEPC水溶解RNA，置于-80℃保存備用。

1.5 反轉錄

取10 μL RNA，2 μL primer mix，1 μL M-MLV，1 μL RNase inhibitor，4 μL 5×RT M-MLV Buffer，2 μL dNTP，混勻。反應程序：42 ℃ 1 h；75 ℃ 15 min；4 ℃ 1 h。制備的cDNA模板-20℃保存備用。

1.6 RT-PCR反應體系的建立及優化

取2 μL cDNA，2.5 μL 10×PCR Buffer，1.5 μL dNTP，0.5 μL Taq酶，上、下引物各0.4 μL，超純水補至25 μL。反應程序：94 ℃，4 min；94 ℃，30 s；X ℃，30 s；72 ℃，30 s,30個循環；72 ℃，10 min；4 ℃保存。設置7個退火溫度(X)，分別是：49 ℃、51 ℃、53 ℃、55 ℃、57 ℃、59 ℃、61 ℃。所得PCR產物經3%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.7 陽性質粒的制備

將PCR產物進行回收，連接pMD-18T載體，16 ℃作用30 min，將連接產物轉化至DH5α感受態細胞，涂板。挑取平板上單個菌落進行搖菌，菌液PCR進行鑒定，將疑似陽性菌液送公司測序，待序列正確后，將相對應的菌液進行質粒提取，-20℃保存備用。

1.8 RT-PCR方法的特異性檢測

以SIV、CSFV、PoRV、PEDV、TGEV、大腸桿菌(E.coli)反轉錄制備的cDNA為模板，以無菌水為陰性對照，利用優化后的擴增體系進行RT-PCR擴增，檢測該方法的特異性。

1.9 RT-PCR方法的敏感性測定

利用 pMD-18T載體構建重組質粒，測定其濃度并計算拷貝數。進一步將構建的重組質粒按照10-1、10-2、10-3……10-10，進行10倍倍比稀釋，以不同稀釋度的重組質粒為模板，進行RT-PCR擴增，測定該方法的敏感性。

1.10 臨床樣品的檢測

利用建立的RT-PCR方法對2015—2017年從上海周邊豬場采集的518份豬腹瀉糞便樣品進行PDCoV病原檢測。同時，利用其他相關豬腹瀉病毒引物(PKV、PAstV、PEDV、TEGV)對PDCoV陽性樣本進行檢測，以了解PDCoV病原與其他豬腹瀉病毒的混合感染情況。

1.11 M基因的遺傳進化分析

運用DNAstar軟件將測序獲得的10份陽性毒株的核酸序列與GenBank中公布的PDCoVM基因序列進行比對分析，并繪制遺傳進化樹。

2 結果與分析

2.1 RT-PCR檢測方法的建立

以腹瀉糞便樣品提取的總RNA為模板，進行RT-PCR擴增，獲得與目的片段大小一致的條帶，約為281 bp(圖1)，且無非特異性擴增，測序表明所擴增的產物為PDCoV基因片段。

2.2 RT-PCR最佳退火溫度的確定

RT-PCR結果顯示，Tm在49—61℃時能夠特異性的擴增出目的條帶，當Tm為53 ℃時所得到的條帶相對較亮，故53 ℃為最佳退火溫度(圖2)。

2.3 RT-PCR靈敏度的確定

將制備的陽性質粒(3.92 x1010copiesμL)10倍倍比稀釋后，分別進行RT-PCR試驗，如圖3所示，RT-PCR檢測PDCoV靈敏度的最低拷貝數為3.92 x103copiesμL。

2.4 RT-PCR特異性分析

如圖4所示，相同條件下，以SIV、CSFV、PoRV、PEDV、TGEV、大腸桿菌(E.coli)和H2O為模板，未能擴增出條帶，而以PDCoV為模版能擴增出特異性目的條帶，說明建立的方法特異性強，與其他病原無交叉反應。

2.5 臨床樣品檢測

利用本研究建立的RT-PCR方法對518份豬腹瀉樣品進行PDCoV檢測，結果顯示25份樣品為陽性，測序證實均為PDCoV，該方法陽性檢出率為4.8%。在所檢出的陽性樣本中，PKV和PAstV與PDCoV的混合感染率分別為40%和48%；PDCoV與PEDV混合感染率為8.0%，未檢測到PDCoV與TEGV混合感染的樣本。

2.6 PDCoV M基因的遺傳進化分析

利用Mega6.0軟件對10株上海地區流行毒株PDCoV的M基因進行基因序列的遺傳進化分析和同源性比對發現，上海地區流行毒株的M基因間的同源性為95%—99.6%(圖5)。進一步序列分析發現，它們與國內PDCoVM基因參考序列的同源性為96.8%—100%，其中FM-1與四川株(S27-2012)和湖北株(CHN-JS-2014)的核酸同源性為100%。

通過分析PDCoVM基因進化樹得知，臨床檢測到的10株上海地區流行毒株(FM-1、FM-2、JD-1、JD-2、JS-1、JS-2、JS-3、JS-4、JS-5、JS-6)的M基因序列與從GenBank中所選取得到PDCoVM基因(表2)參考序列屬于同一分支。這些序列與國內報道的豬Delta冠狀病毒的親緣關系較近，而與國外的豬Delta冠狀病毒親緣關系較遠(圖6)。

表2 M基因進化樹參考毒株

3 結論與討論

PDCoV于2012年首次在香港的豬群中檢測到，相繼在美國、韓國流行[7]。2015年，董楠等[8]對湖北、江蘇、廣東、河南、安徽等地規模化豬場的215 份糞便樣品進行檢測，共檢測到14份PDCoV陽性樣品，陽性率為6.5%；彭艷伶等[9]對四川省涼山地區豬腹瀉樣本中的PEDV、PDCoV和GARV進行檢測，PDCoV檢出率高達33.33%；劉玲玲等[10]利用PDCoV和TGEV雙重RT-PCR檢測方法對河南各地市的252份樣品進行檢測，PDCoV陽性率12.30%。本研究利用RT-PCR方法對2015—2017年上海周邊豬場的518份豬腹瀉樣品進行PDCoV病原檢測，結果檢測出25份陽性樣品，陽性率為4.8%，表明PDCoV在腹瀉豬群中存在一定比例。PDCoV、PEDV 和TGEV 均屬于冠狀病毒，易發生混合感染，且它們感染所引起的臨床癥狀非常相似。 Jung 等[11]對美國俄亥俄州59 份豬腹瀉病料檢測顯示，PDCoV陽性率為29%，PEDV和PDCoV 的混合感染率為42.86%。本研究中，PEDV 和PDCoV 的混合感染率為8.0%，未檢測到PDCoV與TEGV混合感染的樣本；值得注意的是PKV和PAstV與PDCoV的混合感染率分別為40%和48%，表明PKV和PAstV對于PDCoV的致病力可能起協同或是加重作用。

相比于其他豬冠狀病毒，PDCoV的檢測和診斷方法仍處在發展中階段[12]。目前，對于PDCoV病原的檢測方法主要包括病原學檢測和抗體檢測。RT-PCR技術憑借其便捷、靈敏度高、特異性強等特性已成為基因研究和分析的最常用方法之一。病原學檢測正是以PCR技術為基礎建立的檢測方法，Zhang等[13]利用豬Delta冠狀病毒的M基因建立了此病毒的多重RT-PCR和TaqMan qRT-PCR檢測方法。逢鳳嬌等[14]建立了PDCoV的RT-PCR檢測方法，PDCoV最低檢測限為6.33×104copiesμL。鄭蘭蘭等[15]利用熒光定量PCR技術建立了豬δ冠狀病毒的檢測方法。在抗體檢測方面，Thachil等[16]以S1蛋白和N蛋白作為包被抗原，建立了PDCoV抗體的間接ELISA檢測方法，并運用此方法對355份血清樣本進行了檢測。

本研究建立的RT-PCR方法，具有較好的靈敏性和較強的特異性，最低檢測限量可達3.92×103copiesμL，其靈敏度高于逢鳳嬌等[14]建立的方法。對擴增的M基因同源性分析表明，10株上海地區流行毒株的M基因間的同源性達95.0%—99.6%，與GenBank登錄的其他PDCoVM基因序列同源性為96.1%—100%，說明本研究檢測到的PDCoV流行株之間遺傳差異較小，但仍需持續監測。