家蠶卵形指數對孵化率的影響及孵化相關基因表達分析

王雪珍　徐嬌　王閃閃　浦月霞　沈興家　唐順明

摘要：【目的】分析家蠶卵形指數對孵化率的影響規律，以及孵化酶基因（BmHE I和BmHE II ）、幾丁質酶基因（Chitinase）和周期蛋白基因（Period）在不同卵形間的表達規律，為闡明家蠶卵形指數與孵化率的相關性及其分子機理打下基礎。【方法】調查家蠶Nistari品種野生型正常形品種（Nistari+）及其新突變體紡錘形品種（Nistari-）的卵形指數、孵化率、受精率和轉青死卵率，分析其卵形指數與孵化率的相關性;并通過實時熒光定量PCR檢測蠶卵胚胎發育后期孵化相關基因的表達情況。【結果】Nistari+蠶卵的平均卵形指數為1.26，極顯著低于Nistari-蠶卵（1.73）（P<0.01，下同）;孵化率為96.22%，極顯著高于Nistari-蠶卵（51.33%）。當Nistari+蠶卵的卵形指數為1.24～1.25時，其孵化率（97.39%）和受精率（98.84%）均最高，轉青死卵率最低（2.61%）;而Nistari-蠶卵的卵形指數為1.77～1.81時，其孵化率（56.52%）和受精率（74.87%）均最高，轉青死卵率最低（43.48%）。相關分析結果表明，Nistari蠶卵孵化率、受精率和轉青死卵率與卵形指數存在一定的相關性，且受卵形指數影響。在蠶卵胚胎發育后期（孵化前），Nistari+蠶卵的BmHE I、BmHE II、Chitinase和Period基因大量表達，對應的相對表達量顯著（P<0.05）或極顯著高于NISTAR-蠶卵。【結論】家蠶Nistari品種的卵形指數與孵化率存在一定相關性，而BmHE I、BmHE II、Chitinase和Period基因的表達差異是導致Nistari-蠶卵與Nistari+蠶卵孵化率差異的分子基礎。

關鍵詞： 家蠶;Nistari品種;卵形指數;孵化率;孵化相關基因

中圖分類號： S882.4? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）12-3109-07

Abstract：【Objective】The effects of silkworm egg shape index （ESI） on hatching rate（HR）， and the expression patterns of hatching enzyme genes（BmHE I and BmHE II）， chitinase gene（Chitinase） and period protein gene（Period ） in different egg shapes were investigated， which laid a foundation for elucidating the correlation between egg shape index and hatching rate of silkworm eggs and its molecular mechanism. 【Method】The ESI， HR， fertilization rate（FR）， and mortality rate in egg with pigmentary body of embryo（MR） were investigated between the wild type normal egg variety（Nistari+）and its new mutant spindle egg variety （Nistari-）， and the correlation of ESI with HR were analyzed. And investigated the differences in gene expression levels related to hatching process in the later stages of embryonic development by real-time quantitative PCR. 【Result】The mean ESI of Nistari+ was 1.26， which was extremely lower than that of Nistari-（1.73）（P<0.01，the same below）; the HR of Nistari+was 96.22%， which was extremely higher than that of Nistari- silkworm eggs（51.33%）. When the ESI of? Nistari+ was 1.24-1.25， the HR （97.39%） and FR（98.84%） were the highest and the MR（2.61%） was the lowest， while when the ESI of Nistari- was 1.77-1.81， the HR（56.52%） and FR（74.87%） of its eggs were the highest， MR was the lowest（43.48%）. The results of correlation analysis showed that there was a certain correlation between the Nistari ESI and HR， FR and MR， and was affected by ESI. In the later stages of silkworm egg embryo development（before hatching）， the expression levels of BmHE I， BmHE II， Chitinase and Period genes of Nistari+ silkworm eggs were high， and were significantly（P<0.05） or extremely（P<0.01） higher than those of Nistari_ silkworm eggs（P<0.05）. 【Conclusion】There is certain correlation between ESI and HR of silkworm Nistari varieties. The differe-nces in expression of four genes， BmHE I， BmHE II， Chitinase and Period， are the molecular basis for the differences in HR between silkworm varieties of Nistari- and Nistari+.

Key words： sailkworm（Bombyx mori）; Nistari varieties; egg shape index; hatching rate; hatching related genes

Foundation item：National Natural Science Foundation of China（31372376，31672490）;Jiangsu Natural Science Foundation（BK20141285）

0 引言

【研究意義】家蠶（Bombyx mori）是一種重要的鱗翅目經濟昆蟲，在農業經濟體系中占據重要地位。孵化率是衡量蠶種質量的一項關鍵性指標，其影響因素包括蠶種品質、制種季節、蠶卵營養、冷藏時間和催青條件等（李燕飛等，2018;高海青等，2019），其中蠶種的卵形及卵重等品質指標對蠶卵孵化率有明顯影響（潘明德等，2019）。因此，研究分析家蠶卵形指數對孵化率的影響及其分子機理，對提高蠶種孵化率、蠶種選育與保存具有重要意義。【前人研究進展】昆蟲胚胎孵化后才能進行后續的生長發育（Young et al.，2000;Bowles et al.，2008），除了溫度、濕度和光照等外部條件對昆蟲的胚胎發育有影響外，其內部的基因表達調控網絡也會對昆蟲孵化及后期發育有顯著影響（張艷，2020）。高頌等（2012）研究發現，幾丁質酶（Chitinase）主要在昆蟲表皮和中腸中表達，與幼蟲蛻皮、化蛹和成蟲羽化及翅的延展有關。Tao等（2017）研究表明，大多數昆蟲的孵化過程受生物鐘調控機制嚴格調節，其中周期蛋白基因（Period）在生物鐘信號通路中扮演重要角色。家蠶孵化也呈明顯的時間節律性，故推測其受Period基因的調控。至今，有關蠶卵孵化的研究已有較多報道。Lu等（2010）在蠶卵孵化過程中發現，消化液從成熟胚中分泌溶解并軟化卵殼，從而有利于蟻蠶孵化。Tang等（2012）研究表明，在蠶卵孵化過程中BmHE I和BmHE II兩種孵化酶基因的表達趨勢與其孵化進程基本一致。Tao等（2017）研究發現，家蠶蟻蠶從含有大量幾丁質的卵殼中孵化出來，需依賴幾丁質酶將幾丁質降解為寡糖，即蠶卵的孵化過程需要幾丁質酶參與。【本研究切入點】已有研究證實禽蛋孵化率與蛋形指數（禽蛋長軸與短軸間的比值）有關。朱振鵬等（2013）研究認為，揚州鵝種蛋的蛋形指數在1.32～1.46時其孵化率最高;張楠楠等（2014）研究發現，肉雜雞種蛋的蛋形指數在1.25～1.30和1.31～1.37 時孵化效果較好，而在1.19～1.24時孵化效果較差。但針對家蠶卵形指數與其卵孵化率間的相關研究至今未見報道。【擬解決的關鍵問題】調查家蠶Nistari品種野生型正常形卵（Nistari+）及其新突變體紡錘形卵（Nistari-）的卵形指數、孵化率、受精率和轉青死卵率，分析家蠶卵形指數對孵化率的影響規律，以及孵化酶基因（BmHE I和BmHE II）、幾丁質酶基因（Chitinase）和周期蛋白基因（Period）在不同卵形間的表達規律，為闡明家蠶卵形指數與孵化率的相關性及其分子機理打下基礎。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

家蠶Nistari品種的野生型正常形品種Nistari+（圖1-A）及其新突變體紡錘形品種Nistari-（圖1-B）由江蘇科技大學/中國農業科學院蠶業研究所保存提供。其中，Nistari+品種的蠶卵呈橢圓形，Nistari-品種的蠶卵呈紡錘形。2個品種的蠶卵孵化后，幼蟲在25 ℃、相對濕度（65±5）%、12 h光照/12 h黑暗的條件下桑葉飼養，上蔟結繭、化蛹、羽化產卵和蠶卵催青等按常規管理條件進行操作。

1. 2 品種間卵形指數及孵化率調查

以正常產卵的框制種Nistari+和Nistari-蠶卵為材料，以蛾圈為單位，每個蛾圈調查50粒卵，調查10個蛾圈。在Leica體視顯微鏡下測量蠶卵的縱徑和橫徑，計算卵形指數。調查后的蠶種按常規催青條件進行催青，待蠶卵完全孵化后，統計不同品種蛾圈內的總卵數、孵化卵數、受精卵數和轉青死卵數，計算蠶卵的孵化率、受精率和轉青死卵率。3次重復，取平均值，比較Nistari+和Nistari-品種間的卵形指數和孵化率差異。

卵形指數=縱徑長度（長軸）/橫徑長度（短軸）

孵化率（%）=孵化蠶卵數/受精卵數×100

受精率（%）=受精卵數/總卵數×100

轉青死卵率（%）=（受精卵數-孵化卵數）/受精卵數×100

1. 3 品種內卵形指數及孵化率調查

以正常產卵Nistari+和Nistari-散卵為材料，每個供試品種取3000粒卵，按1.2的方法計算卵形指數后放入預先標記好的不同卵形指數小組內，每組100粒卵。調查后的蠶種按常規催青條件進行催青，待蠶卵完全孵化后，按1.2的方法調查不同卵形指數小組內的總卵數，統計孵化卵數、受精卵數和轉青死卵數，計算蠶卵的孵化率、受精率和轉青死卵率。3次重復，取平均值，分別分析Nistari+蠶卵及Nistari-蠶卵不同卵形指數與孵化率、受精率和轉青死卵率的關系，并進行相關分析。

1. 4 4個孵化相關基因表達差異比較

以肌動蛋白3（Actin3）為內參基因，比較蠶卵胚胎后期孵化相關基因（BmHE I、BmHE II、Chitinase和Period）的表達差異。所用引物及其序列信息見表1，均委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以Nistari+和Nistari-蠶卵催青第7、8、9和10 d（蠶卵胚胎發育后期）的散卵各100 mg為材料，按TRIzol試劑盒說明提取總RNA，獲得的蠶卵總RNA用適量DEPC水溶解，并稀釋至500 ng/?L。取1 ?g RNA反轉錄合成cDNA第一鏈，具體步驟按照First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒（TaKaRa公司）說明進行操作。以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR檢測，反應體系50.0 ?L：2×Ultra SYBR Mixture 25.0 ?L，上、下游引物（10 ?mol/L）各1.0 ?L，cDNA模板2.0 ?L，ddH2O補足至50.0 ?L。擴增程序：95 ℃預變性2 min;95 ℃ 15 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進行30個循環。

1. 5 統計分析

試驗數據采用Excel 2016進行統計整理，運用SPSS 17.0進行差異顯著性分析，并以Origin 8.0制圖。

2 結果與分析

2. 1 Nistari+和Nistari-蠶卵的卵形指數及其孵化率

由表2可知，Nistari+蠶卵的平均卵形指數（1.26）極顯著低于Nistari-蠶卵（1.73）（P<0.01，下同）;Nistari+蠶卵的卵形指數最大值為1.29、最小值為1.22，而Nistari-蠶卵的卵形指數最大值為1.81、最小值為1.65。Nistari+和Nistari-蠶卵的孵化率分別為96.22%和51.33%，二者差異極顯著。可見，平均卵形指數較小有利于Nistari+蠶卵孵化，平均卵形指數較大不利于Nistari-蠶卵孵化。

2. 2 Nistari+蠶卵卵形指數與孵化率、受精率和轉青死卵率的關系

由表3可知，第1～4組Nistari+蠶卵的卵形指數分別在1.22～1.23、1.24～1.25、1.26～1.27和1.28～1.29，其中以第4組最高、第1組最低;第2組Nistari+蠶卵的孵化率最高，為97.39%，極顯著高于其他3個組別;第1、第3、第4組Nistari+蠶卵的孵化率分別為95.88%、96.93%和94.68%，組間差異均達極顯著水平。第2組Nistari+蠶卵的受精率最高，為98.84%，極顯著高于其他3個組別;第2組Nistari+蠶卵的轉青死卵率最低，僅為2.61%，極顯著低于其他3個組別。可見，卵形指數為1.24～1.25更有利Nistari+蠶卵受精和孵化，其受精率和孵化率均最高。

2. 3 Nistari-蠶卵卵形指數與孵化率、受精率和轉青死卵率的關系

由表4可知，第1～4組Nistari-蠶卵的卵形指數分別為1.65～1.68、1.69～1.72、1.73～1.76和1.77～1.81，其中以第4組最高、第1組最低;第4組Nistari-蠶卵的孵化率最高，為56.52%，極顯著高于其他3個組別;第1、第2和第3組Nistari-蠶卵的孵化率分別為50.43%、47.87%和50.48%，其中第1組與第3組的差異不顯著（P>0.05，下同），但二者極顯著高于第2組。第4組Nistari-蠶卵的受精率最高（74.87%），極顯著高于其他3個組別;第2組Nistari-蠶卵的受精率最低（54.59%），極顯著低于其他3個組別。第4組Nistari-蠶卵的轉青死卵率最低，為43.48%，極顯著低于其他3個組別。可見，卵形指數在1.77～1.81更有利于Nistari-蠶卵受精和孵化，受精率和孵化率均最高。

2. 4 卵形指數與蠶卵孵化率、受精率和轉青死卵率的相關分析結果

根據統計學正態分布規律及參考禽蛋相關蛋形指數與孵化率的相關分析方法（韋偏等，2019;黃得純等，2020），采用SPSS 17.0中的最小二乘法進行擬合回歸方程相關分析。由表5可知，卵形指數與Nistari+蠶卵孵化率、受精率和轉青死卵率所對應的回歸方程分別為：y=-2350x2+5878.2x-3578.4、y= -2500x2+6267.6x-3829.9和y=2350x2-5878.2x+3578.4。卵形指數與Nistari-蠶卵孵化率、受精率和轉青死卵率所對應的回歸方程分別為：y=1185.6x2-4045.5x+3499.3、y=2780.9x2-9492.6x+8156.6和y=-1185.6x2+4045.5x-3499.3。綜上所述，蠶卵孵化率、受精率和轉青死卵率與卵形指數存在一定的相關性，且受卵形指數影響。

2. 5 Nistari+和Nistari-蠶卵胚胎發育后期孵化相關基因的表達差異

在常規條件下進行催青，蠶卵在第11 d孵化。選取蠶卵胚胎發育后期即催青第7、8、9和10 d的Nistari+和Nistari-蠶卵，調查比較BmHE I、BmHE II、Chitinase和Period等孵化相關基因的表達情況。結果（圖2）顯示，Nistari+和Nistari-蠶卵的BmHE I和BmHE II基因相對表達量在胚胎發育后期至孵化前均呈逐漸上升趨勢，說明BmHE I和BmHE II基因參與蠶卵孵化過程;Nistari+蠶卵的BmHE I基因相對表達量在催青第7～10 d均極顯著高于Nistari-蠶卵（圖2-A），Nistari+蠶卵的BmHE II基因相對表達量在催青第7～8 d表現為顯著高于Nistari-蠶卵（P<0.05，下同），在催青第9～10 d則表現為極顯著性高于Nistari-蠶卵（圖2-B）。可見，家蠶的BmHE I和BmHE II基因均在蠶卵胚胎發育后期（孵化前）大量合成，且Nistari+蠶卵的合成量遠高于Nistari-蠶卵，可能是導致Nistari-與Nistari+品種間孵化率極顯著差異的主要原因。

由圖3-A可看出，在催青第7、8、9和10 d，Nistari+蠶卵的Chitinase基因相對表達量（分別為0.002、0.004、0.008和0.035）均極顯著高于Nistari-蠶卵（分別為0.001、0.002、0.004和0.010），Nistari+蠶卵的Chitinase基因相對表達量在孵化前1 d（催青第10 d）達最高值（0.035），遠高于催青第7～9 d的Nistari+蠶卵Chitinase基因相對表達量。說明Nistari+蠶卵的Chitinase基因在孵化前1 d大量合成，且極顯著高于Nistari-蠶卵，可能是導致Nistari-蠶卵與Nistari+蠶卵孵化率差異的原因之一。

由圖3-B可看出，在催青第7、8、9和10 d，Nistari+蠶卵的Period基因相對表達量（分別為0.0082、0.0500、0.0253和0.0125）均極顯著高于Nistari-蠶卵（分別為0.0060、0.0039、0.0227和0.0080），Nistari+蠶卵的Period基因相對表達量在孵化前2 d（催青第9 d）達最高值（0.0253），遠高于催青第7、8和10 d的Nistari+蠶卵Period基因相對表達量。說明Nistari+蠶卵的Period基因在孵化前2 d大量合成，且極顯著高于Nistari-蠶卵，推測這也是導致Nistari-蠶卵與Nistari+蠶卵孵化率差異的原因之一。

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（責任編輯 蘭宗寶）