刺五加皂苷B/E 對乳腺癌MDA-MB-231 細胞遷移能力的影響及作用機制研究*

梁 睿，翟溯瀾，呂夢雨，蔣艷婷，韋翠萍，郭冷秋**

1 蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術學院 藥學院&蘇州檢驗醫(yī)學生物技術重點實驗室，蘇州 215009;2 南京醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院，南京211166

乳腺癌是最常見且致死性較高的婦科腫瘤之一，其易轉(zhuǎn)移和侵襲的特點嚴重影響女性患者的生存期和生活質(zhì)量[1]，因此尋求安全有效地抗乳腺癌轉(zhuǎn)移的藥物顯得尤為迫切。中藥刺五加已被證實具有抗心肌缺血、抗疲勞、抗輻射以及抗多種腫瘤細胞的藥理作用[2，3]，其中刺五加皂苷是其重要的活性成分。近年來，越來越多的研究指出，刺五加皂苷具有抗肝癌細胞HepG2、乳腺癌細胞MCF-7 以及胃癌細胞SGC-7901 的作用[4，5]，但通過文獻研究和實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單獨使用刺五加皂苷B 或E 直接殺傷乳腺癌細胞MDA-MB-231 細胞的作用不強。最新研究指出，有氧糖酵解[6，7]是腫瘤細胞的主要供能方式，同時也為腫瘤提供了一個酸性環(huán)境，為其增殖、遷移和侵襲提供了能量保障，因而能夠抑制腫瘤細胞糖酵解的藥物對于抑制腫瘤細胞遷移和侵襲具有重要意義。本研究初步探究了刺五加皂苷B 和E 的復合物，對人乳腺癌增殖、遷移、侵襲和糖酵解相關蛋白的影響，以期為刺五加皂苷B 和E 復合物的開發(fā)利用及尋求抗乳腺癌轉(zhuǎn)移藥物的研發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 細胞株

人乳腺癌細胞株MDA-MB-231 細胞，購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 藥品與試劑

刺五加皂苷B（純度≥98%，批號：wkq16060805）和刺五加皂苷E（純度≥98%，批號：wkq16040502），均為四川維克奇生物科技有限公司產(chǎn)品；兩種皂苷以1∶1 混勻，成為復合物B/E，溶解于DMSO 溶液中，使用時稀釋到所需濃度。CCK8 試劑盒（批號：GB707，日本同仁公司）；胎牛血清（批號：11H228，上海依科賽公司）；DMEM 培養(yǎng)基（批號：8117167，美國Gibco公司）；Matrigel基底膜基質(zhì)（批號：6238005，美國BD 公司）；瑞士吉姆薩染液（批號：183631，武漢賽維爾生物科技有限公司）；HK、PFK-2、Glut-4 和β-actin 一抗（美國CST 公司）；PVDF膜（美國Millipore 公司）；兔二抗（武漢三鷹生物技術有限公司）；所用試劑均為化學純；水為純化水。

1.3 儀器

3110 型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司）；Multiskan FC 多功能酶標儀（美國Thermo 公司）；GelDoc 2000 凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-RAD）。

2 實驗方法

2.1 CCK-8 法檢測刺五加皂苷B/E 對MDAMB-231 細胞增殖活力的影響

采用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)乳腺癌MDA-MB-231 腫瘤細胞，將處于對數(shù)生長期的細胞消化后離心、計數(shù)，將細胞濃度調(diào)整至5×105/mL，均勻接種每孔200 μL 懸液于96 孔細胞培養(yǎng)板中，置37 ℃、含5%的CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞培養(yǎng)12 h 貼壁后，各孔分別加入不同劑量的刺五加皂苷B/E（25、50、100、200、400、800 μmol·L-1）和對照溶劑組（DMSO）繼續(xù)孵育24 h，每組設置6 個復孔，孵育完成后，每孔加入10 μL CCK8 試劑，置37 ℃含5%的CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 h，取出細胞培養(yǎng)板于酶標儀450 nm 波長下檢測其吸光度值。

2.2 細胞劃痕法檢測刺五加皂苷B/E 對MDAMB-231 細胞遷移的影響

取對數(shù)生長期的腫瘤細胞，以每孔3×105個接種于6 孔細胞培養(yǎng)板中，加入培養(yǎng)基使每孔的總體積為2 mL。6 孔板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細胞生長貼壁后棄去上清液，無菌PBS 清洗細胞兩次，清洗后用白色的10 μL 槍頭沿每孔的中線垂直劃痕。劃痕結(jié)束后，無菌PBS 繼續(xù)清洗兩次，加入2 mL 新鮮含藥的1%胎牛血清培養(yǎng)基。實驗共分4 個組：空白組、刺五加皂苷B/E（50、100、200 μmol·L-1）3 種濃度組，每組設置3 個平行孔。24 h 后分別于100 倍顯微鏡下拍照。通過測量剩余無細胞面積與初始劃痕傷口面積的百分比來確定傷口愈合效果。

2.3 Transwell 法檢測刺五加皂苷B/E 對MDAMB-231 細胞侵襲能力的影響

采用DMEM 培養(yǎng)基，對去生長因子的Matrigel以1∶4 進行稀釋混勻，均勻鋪被于Transwell 上室的膜表面，待鋪被完成后小心將小室置于37 ℃培養(yǎng)箱中使其凝固。取5×103個MDA-MB-231 腫瘤細胞接種在Transwell 小室的上室。實驗共分4 個組：空白組、刺五加皂苷B/E（50、100、200 μmol·L-1）3 種濃度組，各組分別加入相應的含藥培養(yǎng)基200 μL，每組設置3 個平行孔。Transwell 下室加入含有15%小牛血清的DMEM 培養(yǎng)基500μL，整個體系置于37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使藥物充分作用于細胞。24 h后用棉簽小心將Transwell 上室中沒有遷移的細胞拭去，取出上室底部的膜，采用4%多聚甲醛固定10min，以瑞士吉姆薩染液進行染色30min，之后置于載玻片上，在200 倍顯微鏡下隨機選5 個視野進行拍照、計數(shù)，計算每個視野的平均值。

2.4 乳酸試劑盒檢測細胞上清液中乳酸含量

取對數(shù)生長期的MDA-MB-231 腫瘤細胞，以2×105個接種于6 孔細胞培養(yǎng)板中（培養(yǎng)體系共計2 mL），于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，進行貼壁，貼壁后小心吸去細胞培養(yǎng)基，空白組加入不含藥物的完全培養(yǎng)基2 mL，刺五加皂苷B/E（50、100、200 μmol·L-1）3 種濃度組分別加入相應的含藥培養(yǎng)基2 mL，每組設置3 個平行孔。細胞經(jīng)藥物處理24 h 后，收集細胞上清液，按乳酸試劑盒說明書進行操作，即設置標準品0、4、8、16、32 和64 nmol·mL-1濃度，用于制備試劑盒標準曲線，同時設置各給藥組，精密吸取細胞上清液10 μL，加于96 孔板后，加入樣品稀釋液使終體積為50 μL。各孔再加入相應的乳酸工作液和酶工作液，終體積為100 μL，振蕩混勻后，室溫避光孵育30 min，以空白孔調(diào)零，450 nm 波長下檢測吸光度值。按照公式r=n/V 計算相應的乳酸濃度

[r 為檢測孔中乳酸濃度；n 為待檢測孔的乳酸量（nmol），按乳酸標準曲線計算得到；V 為加入孔樣本的體積（μL）]。

2.5 PCR 檢測細胞糖酵解相關基因的表達

取對數(shù)生長期的MDA-MB-231 腫瘤細胞，以2×105個接種于6 孔細胞培養(yǎng)板中（培養(yǎng)體系共計2mL），于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，進行貼壁，貼壁后小心吸去細胞培養(yǎng)基，空白組加入不含藥物的培養(yǎng)基2 mL，刺五加皂苷B/E（50、100、200 μmol·L-1）3 種濃度組分別加入相應的含藥培養(yǎng)基2 mL，每組設置3 個復孔。細胞經(jīng)藥物處理24 h 后棄去培養(yǎng)基，采用無菌PBS清洗3 次，加入TRIzol 提取液充分提取細胞中的總RNA。以500ng 總RNA 為模板逆轉(zhuǎn)相應的cDNA，在熒光酶標儀上進行相應的PCR 反應。實驗結(jié)果以2-△△Ct法計算基因表達量，以β 肌動蛋白（β-Actin）作為內(nèi)參基因，計算已糖激酶（HK）、磷酸果糖激酶（PFK）、葡萄糖轉(zhuǎn)運體4（Glut4）基因的相對表達量。

引物序列為HK：正向：5’-CAACATTCTCATCGATTTCACGAA-3’，反向：5’-GATGGCACGAACCTGTAGCA-3’；PFK2:正 向：5’-ACTGAAGGGCTCCCACGGCA-3’，反 向：5’-GGCCGCAGTTTCAGCCACCA-3’；Glut4：正向：5’-CTGCACTCCTTCTTCCCTTT-3’，反向：5’-GCCTGCACTTGAGGAGGATTT-3’；β-Actin：正向：5’-CCTGGCACCCAGCACAAT-3’，反向：5’-GCTGATCCACATCTGCTGGAA-3’。

2.6 Western Blot 法檢測糖酵解相關蛋白的表達

取對數(shù)生長期的MDA-MB-231 腫瘤細胞，以2×105個接種于6 孔細胞培養(yǎng)板中（培養(yǎng)體系共計2 mL），于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，貼壁，貼壁后小心吸去細胞培養(yǎng)基，空白組加入不含藥物的培養(yǎng)基2 mL，刺五加皂苷B/E（50、100、200 μmol·L-1）3 種濃度組分別加入相應的含藥培養(yǎng)基2 mL，每組設置3個復孔。空白組加入相應的DMEM 培養(yǎng)基，各處理組加入相應的含藥培養(yǎng)基各2 mL，于37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，收集各孔細胞，采用RIPA 細胞裂解液進行裂解。BCA 法進行蛋白定量，將蛋白與上樣緩沖液按比例混合后蒸煮制備蛋白樣品，制備結(jié)束進行制膠和SDS-PAGE 電泳。電泳后轉(zhuǎn)膜1.5 h，脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗HK、PFK、Glut4 和β-Actin（1∶1 000 稀釋）過夜。次日，洗膜后加入二抗（1∶2 000 稀釋）孵育1.5 h，TBST 洗膜4 次，每次10 min，于凝膠成像系統(tǒng)上曝光，使用ImageJ 1.45s 軟件作灰度分析。以目標蛋白與內(nèi)參β-Actin灰度值的灰度比值，作為目標蛋白的相對表達水平。

2.7 統(tǒng)計方法

本研究結(jié)果采用Graph Pad Prism 5 軟件進行作圖分析，采用SPSS 21.0 軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，采用Student-Newman-Keuls post hoc 檢驗作組間比較。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 刺五加皂苷B/E 對MDA-MB-231 細胞增殖活性的影響

采用CCK8 法檢測不同濃度刺五加皂苷B/E 對乳腺癌細胞MDA-MB-231 細胞增殖抑制作用。藥物處理24h 后，與空白組相比，刺五加皂苷B/E（25、50、100、200 μmol·L-1）組的吸光度值均未發(fā)現(xiàn)顯著降低，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），刺五加皂苷B/E（400、800 μmol·L-1）組吸光度發(fā)生明顯降低，原因并不是刺五加皂苷B/E 對腫瘤細胞的殺傷作用，而是由于藥物濃度影響了細胞的生存率，表明刺五加皂苷B/E 并不能直接抑制MDA-MB-231 乳腺癌細胞的增殖。見圖1。

3.2 刺五加皂苷B/E 對MDA-MB-231 細胞遷移能力的影響

鑒于刺五加皂苷B/E 在25、50、100、200 μmol·L-1的濃度下劑量不具有直接殺傷腫瘤細胞的作用，因此選取50、100、200 μmol·L-13 種濃度，研究刺五加皂苷B/E 對MDA-MB-231 腫瘤細胞遷移能力的影響。結(jié)果顯示，與空白組相比，刺五加皂苷B/E（100、200 μmol·L-1）組細胞遷移距離明顯減少，且差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖2。結(jié)果表明，刺五加皂苷B/E 具有潛在的抑制MDA-MB-231 乳腺癌細胞遷移的作用。

3.3 刺五加皂苷B/E 對MDA-MB-231 細胞侵襲能力的影響

Transwell 實驗結(jié)果顯示，刺五加皂苷B/E（50、100、200 μmol·L-1）3種濃度組侵襲的MDA-MB-231 乳腺癌細胞數(shù)量均明顯減少，且與空白組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01），見圖3。結(jié)果表明，刺五加皂苷B/E 具有抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231 細胞侵襲的作用。

3.4 刺五加皂苷B/E 對MDA-MB-231 細胞培養(yǎng)上清液中乳酸含量的影響

以乳酸試劑盒對藥物處理后的細胞上清液進行檢測，結(jié)果顯示，刺五加皂苷B/E（50、100、200 μmol·L-1）3 種濃度組均能夠減低MDA-MB-231 細胞培養(yǎng)上清液中乳酸的含量，且與空白組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖4。結(jié)果表明，刺五加皂苷B/E抑制MDA-MB-231 乳腺癌細胞遷移和侵襲的作用，可能與降低乳腺癌細胞乳酸分泌有關。

3.5 刺五加皂苷B/E 乳腺癌細胞MDA-MB-231細胞HK、PFK 及Glut4 基因mRNA 表達的影響

PCR 結(jié)果顯示，刺五加皂苷B/E（50、100、200μmol·L-1）3 種濃度組均能夠降低MDA-MB-231 乳腺癌細胞內(nèi)有氧糖酵解相關HK、PFK 及Glut4 三種基因mRNA 的表達水平，且與空白組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。見圖5。

3.6 刺五加皂苷B/E 對MDA-MB-231 細胞糖酵解相關蛋白的影響

Western Blot 實驗結(jié)果顯示，與空白組相比，刺五加皂苷B/E（50、100、200 μmol·L-1）3 種濃度組使糖酵解相關蛋白HK、PFK 及Glut4 表達水平明顯降低，見圖6。PCR 和Western Blot 的結(jié)果均表明，刺五加皂苷B/E 抑制MDA-MB-231 乳腺癌細胞遷移和侵襲作用的機制可能與抑制乳腺癌細胞有氧糖酵解相關。

4 討論

目前對女性乳腺癌的研究普遍認為，乳腺癌細胞易轉(zhuǎn)移、侵襲的特性極大地增加了患者的死亡率。Hanahan D 等[8]認為，腫瘤細胞代謝異常，即使氧氣充足，腫瘤細胞也能夠優(yōu)先采用糖酵解，而非線粒體氧化磷酸化為其生長、轉(zhuǎn)移、侵襲等惡性生物學行為提供能量；同時糖酵解過程中產(chǎn)生的乳酸也為腫瘤細胞提供了一個酸性環(huán)境，為其轉(zhuǎn)移、侵襲提供重要的環(huán)境支撐。對于侵襲能力較強的乳腺癌MDA-MB-231細胞，其糖酵解相關的蛋白表達是明顯上調(diào)的、且其明顯呈現(xiàn)酸性微環(huán)境，提示抑制MDA-MB-231 腫瘤細胞糖酵解過程可能成為抑制該細胞轉(zhuǎn)移、侵襲的重要方式。

鑒于本課題組前期預實驗發(fā)現(xiàn)，采用刺五加皂苷B 或E 單獨處理MDA-MB-231 及MCF-7 細胞，即使?jié)舛群芨呔荒軌蛞种七@些腫瘤細胞的生長、遷移和侵襲。試驗選取了刺五加苷B/E 混合物的3種濃度（50、100、200 μmol·L-1）進行后續(xù)的遷移和侵襲的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，刺五加皂苷B/E 能夠明顯抑制MDA-MB-231 細胞的遷移和侵襲，且具有一定的劑量依賴性。

本研究發(fā)現(xiàn)，刺五加皂苷B/E 能夠劑量依賴性的抑制腫瘤細胞乳酸的分泌，提示刺五加皂苷B/E對腫瘤細胞糖酵解具有一定的抑制作用。Glut4 是細胞表面重要的葡萄糖轉(zhuǎn)運體，已有研究指出，惡性程度越高的腫瘤細胞表面Glut4 的表達水平也越高[9]。本實驗表明，刺五加皂苷B/E 能夠劑量依賴性的抑制腫瘤細胞Glut4 的表達，進而抑制腫瘤細胞葡萄糖的攝入。在糖酵解途徑中，HK 和PFK 是兩個重要的限速酶，調(diào)控腫瘤細胞糖酵解的過程，研究結(jié)果表明，刺五加皂苷B/E 也能夠劑量依賴性的抑制HK 和PFK 的表達，提示刺五加皂苷B/E 抑制腫瘤細胞遷移和侵襲的機制可能與抑制腫瘤細胞糖酵解相關的Glut4、HK、PFK 和減少乳酸分泌有關。

綜上所述，刺五加皂苷B/E 具有抑制乳腺癌MDA-MB-231 細胞遷移和侵襲的作用，其作用機制可能是調(diào)控腫瘤細胞糖酵解相關的蛋白Glut4、HK、PFK 的表達和抑制乳酸分泌相關，這提示刺五加皂苷B/E 可能成為一種潛在的糖酵解抑制劑。