花粉管通道法轉化荔枝的初步研究

王樹軍 孫進華 李煥苓 王果 李芳 王家保

摘? 要：為開拓荔枝轉基因育種新途徑，以GUS基因作為報告基因，用花粉管通道法轉化授粉后24 h的‘新球蜜荔荔枝雌花，并統計座果率、成苗率、轉化率。結果顯示：共獲得303株實生苗，經PCR檢測和GUS染色法證實外源基因整合到4株荔枝苗基因組中，轉化率為1.32%。此研究結果為荔枝生物技術育種提供了一種簡單有效的途徑。

關鍵詞：荔枝;花粉管通道;轉基因;育種

中圖分類號：S667.1????? 文獻標識碼：A

Abstract： In order to develop a new gene transformation pathway for litchi， the female flowers of Xinqiumili （24 h after pollination） were transformed by the pollen tube pathway method， using GUS as a report gene， and the fruit set percentage， seeding rate， and conversion rate were counted. A total number of 303 seedlings were obtained， and four positive transformed plants were verified according to PCR analysis and GUS staining， the transformation rate was 1.32%. This study would provide a simple and efficient way for the biotechnology breeding of litchi.

Keywords： litchi; pollen tube path; transgenic; breeding

荔枝（Litchi chinensis Sonn.）是華南重要的特色水果，其產業在區域農業經濟中占有重要地位。但采前蒂蛀蟲危害和采后果皮褐變等問題限制了荔枝產業的發展。培育多抗、優質耐貯的新品種是解決荔枝產業發展的根本途徑。由于荔枝遺傳基礎狹窄，缺乏抗性資源，使荔枝抗性育種進展緩慢。但現代植物轉基因技術的興起與發展為荔枝育種提供了新方向。目前，已見報道的成功案例均是通過農桿菌介導法[1]和基因槍法[2]實現荔枝轉基因育種，但這2種方法均必須經過繁瑣的組織培養和再生過程，周期較長。Zhou等[3]在1983年首次提出花粉管通道法，該法巧妙利用有花植物授粉后形成的花粉管外通道，將外源DNA直接導入胚囊，對還處于融合期沒有形成細

胞壁的受精卵細胞或者是早期的胚胎細胞進行轉化。花粉管通道法操作簡單，技術成本低廉，不依賴于組織培養，直接從萌發的種子獲得實生苗篩選轉化株，是一種簡便、高效的轉基因方法[4]。自創立以來已在辣椒[5]、蝴蝶蘭[6]、鐵皮石斛[7]、黑楊[8]、番木瓜[9]等植物育種中得到應用。本研究首次采用花粉管通道法對荔枝遺傳轉化進行探索，旨在尋找一種適用于荔枝的簡便、高效遺傳轉化方法，為加速荔枝生物技術育種進程提供基礎。

1? 材料與方法

1.1? 材料

本研究在中國熱帶農業科學院試驗基地果園進行，選取‘新球蜜荔品種為材料。在第1批雄花將謝，雌花即將大量開放時期，選擇花期相對一致、花穗多、樹體健壯的荔枝樹作為轉基因母樹。農桿菌菌株選用EHA105，植物表達載體選用包含GUS基因的pCAMBIA1301質粒。

1.2? 方法

1.2.1? 農桿菌菌液的制備? 用熱激轉化法將質粒pCAMBIA1301轉入農桿菌EHA105感受態細胞，恢復培養后在添加了卡那霉素（Kan）100?mg/L和利福平（Rif）100 mg/L的LB固體培養基上涂板，利用菌落PCR方法鑒定出陽性單菌落后培養，液體培養基為LB+Kan 100 mg/L+Rif 100 mg/L，在200 r/min，28?℃條件下培養過夜。按1∶100的比例，轉接到含有Kan 100 mg/L+Rif 100 mg/L的1 L液體LB培養基中，在相同條件下擴大培養至OD600為0.8。將獲得的農桿菌菌液5000 r/min離心10 min，收集菌體。然后用1 L轉化緩沖液重懸菌體至OD600值為0.8。農桿菌轉化緩沖液配方為：1/2 MS+100 ?mol/L AS+Silwet L-77（0.05% V/V）+蔗糖（5 mg/L）+0.0l mg/L 6-BA，pH調至5.8。

1.2.2? 農桿菌轉化液對花粉萌發的影響? 在雄花盛花期，摘取帶有淡黃色雄花的花穗，保濕帶回實驗室后，用鑷子將淡黃色雄花花朵摘下，置于40?℃的烘箱內12?h，使其干燥散粉后，利用80目篩子收集金黃色花粉于2 mL離心管內備用。

花粉萌發培養基的制備參照李煥苓等[10]方法，取10 g蔗糖和1 g瓊脂加入到0.5 mg/L硼酸水溶液100 mL，加熱溶解。待培養基溫度冷卻至不燙手，滴加1滴至曲面載玻片上，培養基凝固冷卻后備用。此外，分別制備1/2 MS、1/2 MS+ 100??mol/L AS、1/2 MS+Silwet L-77?（0.05% V/V）、1/2MS+100 ?mol/L AS+Silwet L-77（0.05% V/V）4種液體培養基以及OD600為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0的農桿菌菌液，用于重懸適量花粉，搖勻后靜置5 min，滴加1滴花粉液在冷卻的硼酸固體培養基上，將載玻片放置在28?℃且保濕的環境中。3?h后在Nikon ECLIPSE Ti顯微鏡下觀察載玻片上的花粉萌發情況。

1.2.3? 花粉管生長的熒光顯微觀察? 選取盛花期的花穗疏花，待雌花柱頭微微露白，去雄并套袋隔離。雌花柱頭開裂即將彎曲時進行人工授粉并繼續套袋隔離。授粉后1～10?h，每隔1?h取樣1次;授粉后10～30 h，每隔2 h取樣1次;授粉后30～48 h，每隔6 h取樣1次。每次取10個雌蕊，用卡諾氏固定液固定12 h后轉入70%乙醇中低溫保存備用。熒光顯微觀察前，用8 mol/L NaOH軟化雌蕊4～5 h，蒸餾水沖洗后，在0.05%苯胺藍溶液中染色4 h。壓片后，在ZEISS Stereo Lumar.V12顯微鏡356 nm波長下觀察，分別觀測柱頭上花粉的萌發和花粉管在花柱內的生長情況。

1.2.4? 侵染轉化? 選好試驗樹后，對花穗進行疏花和去雄處理，保留柱頭未開裂的雌花，套袋隔離。待雌花柱頭開裂，將貯藏的花粉用授粉筆點授于雌花柱頭，套袋隔離。根據花粉管生長的熒光顯微觀察結果確定適宜的轉化時機。將制好的農桿菌轉化液倒入大燒杯中，浸沒授粉后的雌花花穗10?s。同時，選擇一些雌花用刀片從花柱基部切割柱頭后用農桿菌轉化液浸沒10?s。對處理的花穗掛牌做標記并做套袋處理，侵染結束1周后去除套袋。待果實成熟后統計座果率，公式如下：

座果率=果實數量/轉化雌花數量×100%。

取種子洗凈，播種，4周后統計成苗率，公式如下：

成苗率=成苗數量/播種種子數量×100%。

1.2.5? PCR檢測? 取播種后長成的實生幼苗葉片提取DNA，做PCR檢測。引物F和R根據潮霉素基因設計（引物序列：F： 5-AAAAGTTCGACA GCGTCTC-3;R： 5-GCGACCTCGTATT?GG?GA?A? T?C-3），PCR反應程序為：94?℃預變性3 min;94?℃變性30 s，58?℃退火30 s，72?℃延伸1 min， 35次循環;72?℃延伸5 min。統計陽性轉化率，公式如下：

轉化率=陽性苗數量/成苗數量×100%。

1.2.6? GUS組織化學染色? 取轉化2周后的部分幼果以及PCR檢測結果為陽性的實生幼苗的根和葉片，切成小塊，用無菌水清洗之后置于GUS染液[50 mmol/L pH 7.0磷酸鈉緩沖液、0.1 mmol/L K3[Fe（CN）6]、0.1 mmol/L K4[Fe（CN）6]、1 mmol/L Na2EDTA、0.1% Triton-100、20%甲醛、0.5 mg/mL X-Gluc加入中、37?℃染色過夜，酒精脫色后在OLYMPUS SZX7顯微鏡下觀察染色結果。

2? 結果與分析

2.1? 農桿菌轉化液對花粉萌發影響研究

花粉管通道法大致有4種：柱頭涂抹法、浸泡法、斷口滴加法和注射法[11-14]。在應用花粉管通道法轉化外源基因時，應根據不同物種花的特性及開花習性選擇適合的方法[15]。柱頭涂抹法、子房注射法、斷口滴加法，均適合用于子房較大的開花植物[16]。而荔枝花小而密，宜選擇浸泡法。花粉能正常萌發是花粉管通道法成功應用的前提條件，因此首先開展了農桿菌轉化液對‘妃子笑花粉萌發影響的研究。顯微觀察并統計發現：經1/2 MS和1/2 MS+AS重懸后的花粉萌發率分別為34%和32%，而經過1/2MS+Silwet L-77、1/2 MS+ AS+Silwet L-77和不同濃度的農桿菌菌液重懸后的花粉萌發率均為0%。由此推斷，轉化液中的乙酰丁香酮（AS）不影響花粉萌發，但Silwet L-77和不同濃度的農桿菌菌液均會抑制花粉萌發（圖1，圖2）。綜上可見，農桿菌轉化液包裹荔枝花粉會抑制花粉萌發，導致無法形成花粉管通道。因此，花粉管通道法中農桿菌就只能借助荔枝雌花授粉后已形成的花粉管通道到達胚囊。

2.2? 花粉管生長的熒光顯微觀察

選取‘新球蜜荔的雌花為母本，以‘妃子笑、‘新球蜜荔的花粉為父本，開展荔枝花人工授粉授精過程的研究，進行花粉管通道生長的熒光顯微觀察。結果顯示，‘新球蜜荔雌花授粉后約8?h，花粉管伸長可達花柱道基部，約授粉16～18 h以后，花粉管穿過花柱道基部繼續向子房延伸。根據觀察結果確定授粉后24 h的雌花為理想的實驗材料（圖3）。

2.3? PCR檢測

本研究共獲得376粒花粉管通道法轉化荔枝種子，播種后得到實生苗303株。提取幼苗葉片DNA后，經PCR檢測證實獲得4株轉化株（圖4），轉化率為1.32%。此外，本研究還比較了柱頭切割對荔枝花粉管通道法的影響（表1），結果顯示，切割柱頭處理不能有效提高轉化效率，但會明顯降低座果率。

2.4? GUS組織化學染色

隨機取轉化2周后的20顆幼果進行GUS染色，染色結果顯示有1顆幼果的胚可見藍色斑點。播種獲得的實生苗進行PCR檢測后，隨機取陽性幼苗的根和葉片進行GUS染色。染色結果顯示，

荔枝轉基因育種的新途徑具有重要的意義。農桿菌介導法和基因槍法均必須經過周期較長的組織培養過程，而利用自身的生殖系統作為載體的花粉管通道法在轉基因育種中卻可避免繁瑣的組織培養和再生過程，能夠直接通過花粉管通道轉化目的基因，且還可克服遠緣雜交的一些障礙，是一種便捷、有效的育種途徑。因為該方法在應用中是通過收獲種子，播種后直接獲得轉化植株，因此，要選擇核大、豐產的荔枝品種進行實驗，如‘新球蜜荔。

花粉管通道法早期的應用主要是將提取并純化的含有目的基因片段的質粒DNA涂抹于雌花柱頭或通過微量注射器注入子房。但由于‘新球蜜荔雌花盛開的季節海南正處高溫天氣，且實驗是在田間活體開展，裸露的質粒DNA在陽光強烈的高溫環境下易降解，難以達到轉化目的。因此，本研究在探明花粉管通道萌發生長規律的基礎上，選擇授粉后24?h為最佳的轉化時機，借助農桿菌攜帶質粒DNA進行轉化，并初步鑒定獲得轉基因實生幼苗。借助花粉管通道使用農桿菌侵染的轉化方法，首先要排除農桿菌自身造成的檢測干擾。因此，本研究選擇載體pCAM?B?I?A?1301中含有內含子的GUS基因作為報告基因，因為農桿菌等原核生物細胞在基因轉錄過程中沒有剪接內含子的能力，所以含有內含子的基因只能在真核生物細胞中表達而不能在原核生物細胞中表達[20]，從而避免農桿菌自身的GUS染色干擾。

花粉管通道法結合農桿菌介導轉化的實驗受外界環境條件影響較大。結果表明，本研究中荔枝的座果率較低，可能是與花期恰遇連續陰雨天氣有關。座果率是影響花粉管通道法轉化的關鍵因素之一。在實際的操作中可通過采取一些有效措施來提高座果率，比如選擇晴天進行實驗，避開中午高溫天氣進行實驗，轉化侵染后套袋等。因為花期雨水會導致落果，而睛天中午強烈的太陽強紫外線會降低農桿菌活性，套袋則既可避免雨水打濕，又可避免陽光直射。另外，部分研究表明，花粉管通道法轉基因操作步驟中會有切割柱頭的處理，目的是縮短侵染路徑，但荔枝花較小，柱頭本身較短，所以影響不明顯。本研究發現，切割柱頭并不能有效提高轉化效率，反而會明顯降低座果率，還會數倍增加工作量，降低實驗效率。

本研究先通過潮霉素抗性基因PCR檢測初步確定了4株轉基因實生幼苗，為不影響幼苗的正常生長，僅在葉片和根部隨機取樣進行GUS染色，結果均呈陽性，這進一步證明外源基因整合到了荔枝基因組內。但由于GUS基因表達的豐度差異，顯色部位多集中在葉脈和根尖。至于是否能穩定遺傳，還需要對實驗植株的下一代進行驗證。

綜上所述，本研究首次將花粉管通道法用于將外源基因導入荔枝，但是轉化效率不理想，后續研究將在本實驗基礎上優化轉化體系，對影響因素進行深入細致研究，以期建立簡便、高效、穩定的荔枝花粉管通道法轉基因技術體系。

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