睡蓮種質資源遺傳多樣性分析及DNA指紋圖譜構建

蘇群 楊亞涵 田敏 卜朝陽 毛立彥 張進忠 潘介春 盧家仕

摘? 要：利用ISSR分子標記技術對從國內外引種的46份睡蓮種質資源進行遺傳多樣性分析，并對其中的原生種及原生變種構建DNA指紋圖譜，旨在闡明其親緣關系基礎上，為睡蓮分類鑒定、雜交育種、功能基因的挖掘和利用及圖位克隆等提供理論依據。結果表明：從100條ISSR引物中篩選出10條多態性高、重復性好的引物，在46份睡蓮種質資源中共擴增出281條帶，平均每條引物擴增條帶數為28.1條，多態性條帶281條，多態性比例為100%;平均Shannon信息指數（I）為0.4197，平均Neis基因多樣性指數（H）為0.2657，平均有效等位基因數（N）1.4139，表現出豐富的遺傳多樣性;遺傳相似系數值在0.51～0.98之間，基于遺傳相似系數建立了聚類樹狀圖，揭示了46份睡蓮種質資源的親緣關系，并在相似系數水平為0.68時，可將所有供試材料聚為6類。對總計24個睡蓮原生種及原生變種構建了DNA指紋圖譜，依據圖譜差異可鑒定不同的睡蓮種質。

關鍵詞：睡蓮種質資源;ISSR分子標記;遺傳多樣性;DNA指紋圖譜

中圖分類號：Q949.746.1????? 文獻標識碼：A

Abstract： The genetic diversity of 46 waterlily germplasm resources introduced within China and abroad was analyzed by the ISSR molecular marker technology， and the DNA fingerprints of the original species and varieties were constructed in order to clarify the genetic relationship and provide a theoretical basis for the classification and identification of waterlily， hybrid breeding and functional gene mining， utilization and map-based cloning. The results showed that 10 primers with high polymorphism and good repeatability were screened out from 100 ISSR primers. A total of 281 bands were amplified from 46 waterlily germplasm resources， with an average of 28.1 bands per primer， 281 polymorphic bands and 100% polymorphic ratio. The average Shannon information index （I） was 0.4197， the average Nei's gene diversity index （H） was 0.2657， and the average effective allele number （N） was 1.4139， which showed abundant genetic diversity. The genetic similarity coefficient was between 0.51 and 0.98. Based on the genetic similarity coefficient， a clustering tree was constructed to reveal the genetic relationship of the 46 waterlily germplasm resources. When the similarity coefficient was 0.68， all the tested materials could be clustered into six groups. DNA fingerprints were constructed for 24 original species and varieties of waterlily， and different waterlily germplasms could be identified according to the differences of DNA fingerprints.

Keywords： waterlily germplasm resources; ISSR molecular markers; genetic analysis; DNA fingerprintings

睡蓮為睡蓮科（Nymphaeaceae）睡蓮屬（Nymphaea L.）多年生草本宿根花卉。全世界睡蓮屬植物有50余種，主要分布在熱帶、亞熱帶和溫帶地區[1]。我國有5種[2]，也有的報道是4種[3]。睡蓮屬可分為5個亞屬：廣熱帶睡蓮亞屬（Brachyceras）、廣溫帶睡蓮亞屬（Nymphaea）、古熱帶睡蓮亞屬（Lotos）、新熱帶睡蓮亞屬（Hydrocallis）及澳大利亞睡蓮亞屬（Anecphya）[4]。作為水生花卉中的名貴花卉，睡蓮以其豐富的花色、圣潔的寓意及莖葉對水中富營養物和有害物質的強吸附能力，深受人們的喜愛。此外，睡蓮花朵可泡茶，葉柄和花柄可食用，全草宜作綠肥，又可入藥，具有極高的食用價值和觀賞旅游、水景造景價值[5]。

睡蓮種質資源是發展睡蓮鮮切花、食用生產的物質基礎，也是睡蓮研究領域尤其是睡蓮新品種選育和生物技術研究的基礎。我國對睡蓮的研究雖處于起步階段，但發展迅猛，現階段對睡蓮的研究主要集中在引種栽培[6-11]，生殖繁育[12-13]、功能活性[14-17]、生理生化分析[18-20]以及新品種選育[21-23]等方面。對睡蓮種質資源遺傳多樣性和分子圖譜的研究則少有報道，因此，開展睡蓮種質資源的遺傳性狀分析和DNA指紋圖譜構建，有利于充分利用睡蓮種質資源和發掘、創制出性狀優異的睡蓮新種質，對睡蓮育種研究和創新具有十分重要的意義。

ISSR（Inter-Simple Sequence Repeat）分子標記技術是一種基于PCR的新興DNA分子標記技術。與其他分子標記相比，ISSR分子標記具有很大的優越性，如試驗操作簡單、成本低、快速靈敏、穩定性高、所需DNA量少等，而且不需要預先知道研究對象的基因組序列，大大減少了多態性分析的預備工作[24-25]。近年來，ISSR分子標記在其他花卉，如杜鵑[26]、荷花[27]、櫻花[28]、桂花[29]、風信子[30]及百合[31]等種質資源的鑒定與遺傳多樣性分析中得到了廣泛應用。此外，ISSR分子標記技術在構建遺傳圖譜和指紋圖譜尤其是背景種質狹窄的指紋圖譜具有很大潛力[32]。本研究基于ISSR分子標記技術對從國內外引種的46份睡蓮種質資源進行遺傳多樣性分析，并對其中的原生種及原生變種構建DNA指紋圖譜，旨在闡明其親緣關系基礎上，為睡蓮分類鑒定，雜交育種及功能基因的挖掘、利用，圖位克隆等提供理論依據。

1? 材料與方法

1.1? 材料

本研究以46份睡蓮種質為實驗材料，其中含有原生種21個，原生變種3個，園藝品種22個。供試樣本均種植于廣西農業科學院花卉研究所睡蓮種質資源圃。采摘完整的、無病蟲害、未展開的沉水幼葉1～2片，浸沒于裝有純凈水的標記袋中4?℃冰箱保存，樣本順序及編號見表1。

1.2? 方法

1.2.1? DNA提取及檢測? DNA提取采用TIANGEN新型植物基因組DNA提取試劑盒，在1%的瓊脂糖凝膠中電泳檢測DNA質量，用Gene Spec核酸檢測儀檢測DNA純度和濃度。最后將樣品濃度稀釋為50 ng/μL，–20?℃保存。

1.2.2? ISSR-PCR 擴增反應體系及程序? 采用20?μL的反應體系，包含了2×Es Taq Master Mix（含染料）10 μL，供試睡蓮模板DNA及ISSR引物各1 μL，8 μL的ddH2O補齊。PCR擴增程序參考Poczai等[33] 的方法并進行適當優化，具體為：94?℃預變性1 min;94?℃變性45 s，不同溫度下退火45 s，72 ℃延伸2 min，共35個循環; 72?℃延伸5 min，4?℃保存?ISSR-PCR反應產物用1.8%的瓊脂糖凝膠電泳，緩沖液為1TAE。

1.2.3? ISSR引物合成及篩選? 根據加拿大哥倫比亞大學設計并公布的ISSR引物序列，由上海生物工程有限公司合成本實驗需用的100條ISSR引物。預先用5個不同睡蓮亞屬供試樣本進行初篩，最后選取10條重復性好、條帶清晰、多態性高的引物用于本實驗。

1.3? 數據處理

根據ISSR圖譜條帶的有無，利用人工方法統計讀帶，將圖譜中穩定出現且肉眼可見的電泳條帶賦值為“1”，同一擴增水平位置無電泳條帶賦值為“0”，將讀帶數據輸入Excel表格，建立原始矩陣數據庫，統計擴增產物的條帶總數和多態性條帶數。用POPGEN 1.32軟件計算多態位點百分率、Neis基因多樣性指數（H）、有效等位基因數（Ne）和Shannon多樣性信息指數（I）。用軟件NTSYS 2.10e計算遺傳相似系數GS（genetic similarity），根據GS值按非加權配對算術平均法（UPMGA）進行聚類分析，建立聚類圖。

2? 結果與分析

2.1? 引物擴增多態性及遺傳多樣性分析

2.1.1? 引物擴增多態性分析? 采用試劑盒提取的46份睡蓮基因組DNA電泳結果見圖1。10條ISSR引物在46份睡蓮種質資源中共擴增出281條譜帶，其中281條均具有多態性，占100%（表2）。單條引物擴增出的清晰條帶數在23～35條之間，擴增位點數最多引物為UBC835，擴增出35個位點，最少為UBC845，有23個位點，平均多態性條帶28.1條。可見ISSR檢測睡蓮屬種質資源遺傳多樣性的效率很高，也表明睡蓮屬種質資源在分子水平上具有極為豐富的遺傳多樣性。引物UBC?841對46份睡蓮種質基因組DNA的擴增結果如圖2所示。

2.1.2? 遺傳多樣性分析? 等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）、Shannon多樣性信息指數（I）和Nei's基因多樣性指數（H）均是衡量遺傳多樣性水平的常用指標，是目前應用較為廣泛的遺傳多樣性指數。46份睡蓮種質資源的平均Na、Ne、H和I值分別為2.000、1.4139、0.2657和0.4197（表3）。

2.2? 睡蓮種質資源的ISSR聚類分析

2.2.1? 遺傳相似系數? 利用10個引物產生的標記信息，建立了供試樣本的相似系數矩陣。遺傳相似系數值越大，說明材料間的親緣關系越近，反之，親緣關系越遠。46份睡蓮種質資源的遺傳相似系數在0.51～0.98之間，平均遺傳相似系數為0.78。其中24號的白藍星與43號藍星種質之間的遺傳相似系數最大為0.98，說明他們之間的親緣關系最近，遺傳差異相對較小。7號的秘魯睡蓮與35號的紫色幻想之間的遺傳相似系數最小為0.51，說明他們之間的親緣關系最遠，遺傳差異相對較大。

2.2.2? 聚類分析? 為了確定各供試材料間的遺傳關系，通過軟件NTSYS 2.10e對46份睡蓮種質資源計算遺傳相似系數GS（genetic similarity），根據GS值按非加權配對算術平均法（UPMGA）進行聚類分析，建立遺傳關系聚類圖（圖3）。由圖3可知，供試材料以遺傳相似系數0.68為閾值時，可將46份睡蓮種質資源聚為6類，第I類由屬于廣溫帶亞屬的12份睡蓮種質資源組成，其中的12號小白子午蓮單獨聚成一支;第II類由屬于人工跨亞屬雜交育成的跨亞屬的4份睡蓮種質資源組成，具體為35號紫色幻想與41號詩麗吉皇后聚在一起，36號暹羅紫與39號暹羅粉聚在一起。第II類的4個人工雜交的跨亞屬品種，在遺傳相似系數0.66時與第I類的廣溫帶亞屬聚在一起，說明相對于其他亞屬，第II類人工雜交的跨亞屬品種與廣溫帶亞屬親緣關系較近。這在表觀形態特征上也能體現，如上述跨亞屬雜交的4個品種葉片呈橢圓或卵圓型，葉片邊緣全緣，花朵浮于或略高于水面，其均是典型的廣溫帶亞屬睡蓮具有的特征，但其花部特征尤其是雄蕊與廣溫帶亞屬睡蓮差異較大;第III類由屬于廣熱帶亞屬的16份睡蓮種質資源組成，其中小花睡蓮、21號暹羅皇后、34號華麗、37號約瑟芬及40號紫喬伊這5份睡蓮種質資源聚在一起;第IV類由同屬于澳洲亞屬的4份睡蓮種質

圖3? 46份睡蓮種質資源基于ISSR的遺傳相似性聚類分析

Fig. 3? Cluster analysis of 46 waterlily germplasm resources based on ISSR genetic identities

資源組成，具體為3號藍巨睡蓮和42號白巨睡蓮聚在一起，8號變色澳洲睡蓮與13號澳洲IM睡蓮聚在一起;第V類由3種同屬于新熱帶亞屬的睡蓮種質組成，其中27號具備花胎生能力的增殖睡蓮單獨聚為一支;第VI類由同屬于古熱帶亞屬的7份睡蓮種質組成，其中19號喀麥隆睡蓮單獨聚為一支。

2.3? 部分睡蓮種質資源的DNA指紋圖譜構建

用篩選出的10個ISSR引物對24個睡蓮原生

種及變種構建DNA指紋圖譜，通過對比發現引物UBC840和UBC841均可單獨鑒別出24份睡蓮原生種質資源。本研究利用UBC840構建了24份睡蓮原生種質資源DNA指紋圖譜（圖4），其中黑色表示該位點有條帶，即該位點0-1矩陣中為“1”，無色表示該位點無條帶，即該位點在0-1矩陣中為“0”。構建的指紋圖譜可用于24份睡蓮原生種質資源的分類與鑒定。

圖4? 基于UBC840分子標記構建的睡蓮原生種及原生變種的DNA指紋圖譜

Fig. 4? DNA fingerprint of primordial species and varieties of waterlily based on UBC840 molecular markers

3? 討論

3.1? 睡蓮種質資源遺傳多樣性及親緣關系分析

遺傳多樣性是生物所攜帶的遺傳信息總和，是每種生物所固有的特性，一個種群遺傳多樣性越高或越豐富，在環境發生變化時生存下來的可能性就越大，越容易擴展其分布范圍和開拓新環境[34-35]。ISSR分子標記具有擴增多態性高、穩定性好、操作簡便等優點[36]，現已被應用于熱帶睡蓮的遺傳關系分析、雜交種鑒定[33]、聚群內遺傳變異及基因流分析中[37]。本研究通過反復試驗，得到優化后的ISSR-PCR體系，篩選出10個引物

對46份睡蓮種質資源進行了擴增，多態性位點百分率高達100%，Shannon信息指數（I）為0.4197，有效等位基因數（Ne）為1.4139，Neis基因多樣性指數（H）為0.2657，表明睡蓮種質資源具有極為豐富的遺傳多樣性，蘊涵著廣泛的遺傳變異，這也與張海平[38]通過研究睡蓮的表觀性狀多樣性及同工酶分析得出的結果一致，同時也說明ISSR分子標記可以較好地用于睡蓮屬的多樣性分析。睡蓮屬植物開花習性表現為雌蕊先熟（protogyny）[1]，這種性成熟時間自然隔離特點導致絕大部分睡蓮屬植物為異花授粉，致使睡蓮屬植物種間基因交流頻繁，雜合度和多態性很高，可能是影響其種間在形態和分子遺傳特性上的巨大差異的重要原因。實驗結果顯示，供試睡蓮屬種質資源的遺傳相似系數為0.51～0.98，豐富的遺傳多樣性為睡蓮雜交親本選擇和育種提供了重要的科學依據。從聚類圖上看，在閾值0.78時，很多睡蓮屬種質資源單獨聚成一支，說明其與同亞屬的其他睡蓮種質資源差異較大，親緣關系較遠，而且很多均是育性非常好的原生種質資源，如12號小白子午蓮，32號米奴塔等，其育種潛力還未被完全開發，可作為亞屬內或跨亞屬雜交時的優良親本選擇。

睡蓮屬下分類現今依舊沒有非常明確的標準。根據生態學特征，通常將睡蓮分為耐寒睡蓮（hardy waterlily）和熱帶睡蓮（tropical waterlily）2大類[1]，根據心皮的離生或聚合以及花柱的有無可將睡蓮屬植物分為2大組5個亞組[1， 9]，根據地理來源可將睡蓮屬分為5或6個亞屬[4， 39]，即將睡蓮屬分為：廣溫帶亞屬、廣熱帶亞屬、古熱帶亞屬、新熱帶亞屬及澳洲亞屬，后4個亞屬通常簡單稱為熱帶睡蓮。本研究以遺傳相似系數GS值按非加權配對算術平均法（UPMGA）進行聚類分析，建立了46份睡蓮種質資源的遺傳關系聚類圖，從聚類圖上看，全部耐寒睡蓮聚在一起構成單系類群，這與張海平[38]基于形態性狀的聚類分析和劉艷玲等[40]基于ITS的睡蓮屬系統分類的研究一致，但熱帶睡蓮分類地位與他們有較大出入。王海平[38]和劉艷玲等[40]認為，熱帶睡蓮聚在一起構成單系類群，在其內部分成2支，一支是印度藍睡蓮、藍星睡蓮等晝開夜閉型睡蓮，另一支則由印度紅睡蓮、埃及白睡蓮為代表的古熱帶亞屬組成的夜開晝閉型睡蓮。本研究顯示古熱帶亞屬單獨聚為一支，且位于聚類圖基部，支持黃國振等[1]提出的認為晚上開花類型是比較原始的，相當于塔氏圖示的第2階段，白天開花類型相當于第4階段，耐寒睡蓮類型相當于第5、第6階段的觀點。此外從聚類圖上看部分地理來源相同的睡蓮種質資源聚在一起，如第IV類供試材料全部來源于澳洲，歸屬于澳洲睡蓮亞屬，具有較近的親緣關系，支持根據地理來源的將睡蓮屬分為5個亞屬的分類方式。

從聚類圖上看，在閾值約為0.69時，可將第III類廣熱帶亞屬分為2支。其一支由9份非胎生能力的睡蓮種質組成，另一支是由7份睡蓮屬種質聚在一起，其中5份具有胎生能力的睡蓮種質聚在一起，說明具有胎生能力的睡蓮種質遺傳關系較近，表明它們很可能具有共同的起源。2份非胎生能力的睡蓮種質分別是11號黃金國和23號蘇皖娜，黃金國俗稱黃色九品香水蓮，是臺灣園林部門在引種美國睡蓮基礎上培育而成[41-42]，蘇皖娜是由泰國著名睡蓮育種家N. Nopchai Chansilpa博士選育出的著名灑金睡蓮名品，這2個品種親本來源復雜，之所以與具胎生能力睡蓮種質聚為一支，很可能是其親本中混有胎生能力的親本祖先，致使其親緣關系更靠近于具胎生能力的睡蓮種質。

3.2? 睡蓮屬原生種質資源分子指紋圖譜

目前，我國在花卉品種資源生產和經營方面尚不規范，品種引種混亂或品種造假的現象時有發生，因此，開展花卉品種資源鑒定顯得尤為重要[43]。傳統的花卉品種資源鑒定方法主要依靠表型特征，雖然快速便捷，但是表型性狀受環境影響較大，鑒別錯誤率較高，加之花卉品種資源逐年擴大，品種的相似度也越來越高，導致通過傳統的表型鑒定方法越來越難[43]。DNA指紋圖譜是指DNA樣品用特定分子標記技術處理顯示出具有特定DNA片段的總稱[44]。DNA遺傳物質由于受環境影響較小、多態性高，基于DNA擴增的PCR技術已經成為花卉品種鑒定最有效的方法[42， 45-46]。絕大部分睡蓮原生種及其變種在未開花前非常相似，很難辨別，如藍星和白藍星，其葉型、葉色都極為相似，需開花后才可區分。少部分在開花條件下也很難區分開，如埃及白睡蓮及其變種柔毛齒葉白睡蓮，花色均為純白色，鋸齒狀葉片，單從表觀形態上很難區分開來，本研究通過篩選出的10個ISSR引物對24個睡蓮原生種及原生變種構建DNA指紋圖譜。分子身份證構建的目的是準確、快速和便捷地鑒別出不同種質的遺傳信息，因此，在進行分子身份構建時，不僅要求標記位點的多態性要豐富，而且檢測方法要操作簡便、重復性強[47]。通過對比發現引物UBC840和UBC841均可單獨鑒別出24份睡蓮原生種質資源。本研究基于引物UBC840構建了24份供試睡蓮原生種質的DNA指紋圖譜，該圖譜可作為相應睡蓮原生種質資源鑒定和分類的依據，同時也為新種質和新品種的分類鑒定及知識產權保護提供分子技術水平上的保障。

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