玻璃體腔注射抗氧化劑NAC對早期糖尿病大鼠視網膜的保護作用

陳 玲，劉彥芳，林 萍

0 引言

隨著生活水平的提高，糖尿病(diabetes millitus，DM)患者在全世界快速增加。國際糖尿病協會發聲，糖尿病的發展將面臨失控，沒有哪一個國家完全有能力遏制糖尿病的發展。糖尿病視網膜病變(diabetic Retinopathy，DR)是糖尿病最為常見和嚴重的神經及微血管并發癥之一，成為全球性四大主要致盲原因之一[1-2]。前期研究表明，抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)對早期糖尿病大鼠視網膜有保護作用[3-4]，其可以抑制糖尿病時活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的生成增加，下調血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、細胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)在視網膜血管的表達[4]。色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)作為神經營養因子，在眼部主要由視網膜色素上皮細胞合成，在DR的進程中作用廣泛。本實驗擬在既往研究的基礎上，觀察抗氧化劑NAC對早期糖尿病大鼠視網膜內核層厚度、神經節細胞數量及視網膜中PEDF表達情況的影響，探討NAC對視網膜保護作用的機制，為更早期的DR進行有效治療提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1材料健康成年雄性SD大鼠30只(由西安交通大學實驗動物中心提供，眼部檢查無異常，體質量約180～220g，實驗動物飼養管理室內有通風換氣設備，保持空氣新鮮，飼料為西安交通大學實驗動物中心供應的標準飼料。按照隨機分配的原則分為正常對照組(normal control group，CON組，n=10)和糖尿病組(DM組，n=20)。糖尿病組(DM組)禁食12h后，按照60mg/kg體質量劑量一次性左下腹腔注射10g/L鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)溶液，正常對照組(CON組)注入等量的檸檬酸緩沖溶液。用藥72h后，鼠尾靜脈取血檢測血糖，≥16.7mmol/L者定為糖尿病模型動物。成模大鼠隨機分為糖尿病對照組(D組，n=8只)和NAC治療組(N組，n=8只)。模型建立后，N組大鼠每周通過玻璃體腔注射4μL 1.6μg/μL的NAC，CON組、D組大鼠則給予玻璃體腔注射4μL 0.01mmol/L的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，不限飲食水，分組喂養。實驗動物在麻醉下進行所有手術(10%水合氯醛腹腔注射過量麻醉大鼠)，并盡一切努力最大限度減少其疼痛、痛苦和死亡，符合實驗動物倫理要求。

兔抗大鼠Thy-1.1多克隆抗體檢測視網膜神經節細胞數量，購于北京博奧森，工作濃度1∶50兔抗大鼠PEDF多克隆抗體購于上海研晶生物，工作濃度1∶50；FITC標記山羊抗兔IgG購于北京博奧森，工作濃度1∶200。圖像信號采集與分析系統：德國Leica 公司(q550cw);熒光顯微鏡，日本OLYMPAS BX51;熒光圖像采集系統：美國QE SPOT INSIGHT。

1.2方法

1.2.1取材糖尿病大鼠成模2mo后，10%水合氯醛腹腔注射過量麻醉大鼠，迅速摘除眼球，在眼球角膜距角鞏緣0.5mm針刺定位，將眼球固定脫水后常規包埋，根據針刺定位點過視神經垂直于子午線平面切成5μm厚的切片。

1.2.2 HE及免疫熒光染色每只眼選擇6張切片，每張切片隨機選取視網膜中央部、中周部、周邊部共5個視野，6張切片測量平均值作為1個樣本。采用計算機圖像分析系統觀察視網膜結構改變，并測量內核層厚度，并以此作為視網膜組織損傷的判斷指標。采用免疫熒光法，按照說明書，結果判定標準：陽性細胞胞漿為熒光綠。

2 結果

2.1各組大鼠視網膜內核層厚度各組大鼠視網膜內核層厚度測定顯示，CON組、D組、N組視網膜內核層厚度(32.062±1.543、21.207±3.603、31.187±1.004μm)比較，差異有統計學意義(F=53.322，P<0.001，圖1)。D組視網膜內核層厚度較CON組下降，差異有統計學意義(P<0.01)，N組視網膜內核層厚度較CON組略下降，差異無統計學意義(P>0.05)。D組視網膜內核層厚度較N組下降，差異有統計學意義(P<0.01)。

2.2各組大鼠視網膜神經節細胞數量各組大鼠視網膜神經節細胞數量檢測表明，CON組、D組、N組視網膜神經節細胞數量(25.25±4.268、5.13±1.808、23.63±3.159個)比較，差異有統計學意義(F=95.334，P<0.001，圖2)。D組視網膜神經節細胞數量較CON組減少，差異有統計學意義(P<0.01)；N組視網膜神經節細胞數量較CON組略下降，差異無統計學意義(P>0.05)。D組視網膜神經節細胞數量較N組下降，差異有統計學意義(P<0.01)。

2.3免疫熒光法觀察視網膜各層PEDF表達情況PEDF陽性反應主要分布于視網膜內核層及神經節細胞層。糖尿病2mo后，大鼠視網膜中PEDF平均光密度的測定表明，CON組、D組、N組視網膜中PEDF平均光密度值(1.363±0.190、0.688±0.119、1.304±0.218)比較，差異有統計學意義(F=34.403，P<0.001，圖3)。D組PEDF表達較CON組下降，差異有統計學意義(P<0.01)。N組PEDF表達較CON組略下降，差異無統計學意義(P>0.05)。D組PEDF表達較N組下降，差異有統計學意義(P<0.01)。

3 討論

DR是糖尿病最為常見和嚴重的神經及微血管并發癥之一，也是影響患者生活質量的主要原因。PEDF是目前發現的最重要的新生血管抑制因子[5]，屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族的一種糖蛋白，在眼部主要由視網膜色素上皮細胞合成，1987年Tombrn-Tink等[6]從胎兒視網膜色素上皮細胞培養液中第一次發現。Ogata等[7]檢測糖尿病患者玻璃體及房水中PEDF含量較正常人明顯降低，而同時VEGF含量增加，提示PEDF除了是一種神經營養因子外還可以抑制新生血管的生成。作用機制主要有：在DR早期通過抑制NADPH氧化酶來發揮抗氧化保護作用[8]；上調Fasl，促進活化的血管內皮細胞凋亡等[9]。糖尿病慢性并發癥的統一機制學說認為：引起糖尿病各并發癥的四條經典通路,即多元醇通路激活、晚期糖基化終末產物(advanced glycosylation end products,AGEs)增加、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)激活及氨基己糖途徑，實質上都是高糖誘導過氧化物過多表達的結果，氧化應激是糖尿病并發癥發生、發展的重要因素[10]。因而抗氧化治療也逐漸被人們所關注。研究表明，腺病毒介導的PEDF以玻璃體腔注射的方式轉染視網膜組織后，視網膜內核層較前增厚，視網膜神經節細胞密度增高，提示外源性PEDF能夠保護視神經損傷后的視網膜神經節細胞，促進視網膜神經節細胞損傷修復,具有神經保護作用[11]。近期也有研究發現，新型PEDF小肽可以減少脈絡膜及視網膜新生血管生成[12]。本實驗中，糖尿病大鼠2mo時，視網膜內核層變薄及視網膜神經節細胞數量減少，從而導致視網膜缺血缺氧可能與視網膜組織中PEDF水平減少有關。

圖1各組大鼠視網膜組織的形態學改變(×400)A：CON組；B：D組；C：N組；GCL；神經節細胞層；IPL：內網層；INL；內核層;OPL；外網層；ONL：外核層；PEL：色素上皮層。

圖2免疫熒光法檢測各組大鼠視網膜神經節細胞(×400)A：CON組；B：D組；C：N組；圖中箭頭所指為顯色的視網膜神經節細胞的胞膜及樹突。

圖3各組大鼠視網膜中PEDF表達情況(×400)A：CON組；B：D組；C：N組；圖中箭頭所指為PEDF表達情況。

NAC是一種含有巰基的抗氧化劑，在以往主要用于呼吸系統疾病的治療。近年研究發現，其不但對于呼吸系統疾病起重要作用，同時在干細胞保護及抗腫瘤的過程中也有重要的保護作用。大量研究發現，其具有抗氧化、減少活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)生成、清除自由基、調節細胞代謝活性、抗細胞凋亡等作用[13]。NAC起作用的優點有：為小分子物質,易于進入細胞,脫乙酰基后成為谷胱甘肽(glutathione,GSH)合成的前體,從而提高組織內GSH含量，增加體內GSH貯存。體內實驗中發現NAC能提高紅細胞、肝臟組織和肺組織中細胞內的GSH水平[14]。有研究顯示：抗氧化劑NAC能不同程度恢復糖尿病大鼠各組織抗氧化水平，從而起到阻止或延緩糖尿病相關的靶器官功能損害的作用[15]。前期研究發現，NAC抗氧化應激可減輕視網膜缺血缺氧狀態，從而減輕視網膜新生血管的生成[4]。本實驗研究發現，糖尿病大鼠2mo時視網膜中PEDF水平已明顯降低，而通過玻璃體腔注射NAC后視網膜中PEDF水平較D組明顯提高，同時視網膜組織較D組破壞減少，提示NAC對早期糖尿病大鼠視網膜組織保護作用，可能是通過NAC的抗氧化應激作用，減輕了視網膜缺血缺氧狀態，從而上調了視網膜中PEDF水平相關。

綜上所述，在糖尿病早期，視網膜缺血缺氧的環境已經使PEDF水平下降，抗氧化劑NAC對早期糖尿病大鼠視網膜組織有保護作用的機制可能是通過上調視網膜中PEDF水平，提示NAC及PEDF有潛在的臨床應用價值。