探究左旋甲狀腺素治療孕期母鼠亞臨床甲減的最佳時期

王 鑫 羅才全 李小蘭 唐 雪

(1. 重慶市黔江中心醫院產科,重慶 409000)(2. 重慶市黔江中心醫院消化內科,重慶 409000)

甲狀腺疾病是僅次于育齡婦女妊娠糖尿病的第二大妊娠期內分泌疾病，與胎兒有著緊密聯系。因此，甲狀腺疾病直接導致不良妊娠結局，嚴重影響胎兒的遠期認知發育。妊娠期合并甲狀腺功能減退癥發生率為0.5%～0.6%，且呈逐年遞升趨勢[1]，其中臨床甲狀腺功能減退癥為0.3%～0.5%，亞臨床甲狀腺功能減退癥為2.0%～3.0%[2]，占甲減患者90%以上。亞臨床甲減(subclinical hypothyroidism，SCH)是一種由于甲狀腺激素(TH)合成和生理效應不足引起的全身性疾病，因其臨床表現不明顯而易被忽略。文獻報道[3]SCH可增加孕婦抑郁癥的發病率，也有相關研究表明[4]SCH可增加妊娠不良結局風險、降低后代智力商數(Intelligence quotient，IQ)評分，說明SCH與妊娠結局以及胎兒健康之間存在一定的相關性。但因SCH具體作用機制不清，因此本研究主要通過建立孕期母鼠亞臨床甲減模型，在不同孕期進行左旋甲狀腺素(L-T4)替代治療，監測孕期母鼠亞臨床甲減對仔鼠腦部發育的影響，從而獲取孕期母鼠治療的最佳時期。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取150只SPF級Wistar雌鼠，體質量為180～200 g，購買于重慶醫科大學動物實驗室，飼養于該大學實驗動物部SPF級動物飼養中心，溫度為(23±4)℃，相對濕度50%，自由攝取食物和水，合格證號：SCXK(渝)2020-023。2周后按數字表法隨機分為6組(n=25)：①對照組；②甲減組；③亞甲減組；④亞甲減治療A組；⑤亞甲減治療B組；⑥亞甲減治療C組。

1.2 動物模型制備

對照組(n=25)：大鼠稱質量后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉后行甲狀腺切除術，術后1個月，皮下以每日0.95 μg/100 g體質量劑量注射血清白蛋白(BSA)的PBS溶液，作為陰性對照液。

甲減組(n=25)：大鼠稱質量后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉后行甲狀腺切除術，術后1個月皮下注射等量BSA的PBS溶液，采取眶后靜脈血檢測甲狀腺功能，當促甲狀腺激素(Thyrotropin，TSH)高于正常，總甲狀腺素(Total thyroxine，TT4)低于最低值(<1 μg/dL)，提示甲狀腺完全切除，成功建立完全甲減模型，若甲狀腺切除不完全則淘汰。

亞甲減組(n=25)：大鼠稱重后，開始皮下注射L-T4，將L-T4裝入泵中，以每日0.95 μg/100 g體質量劑量持續泵入，根據體質量相應調整劑量。10 d后采取眶后靜脈血，檢測甲狀腺功能，當TSH高于正常，而TT4在正常范圍內，提示亞臨床甲減模型建立成功。作為陽性對照組。

亞甲減治療A組(n=25)：在亞臨床甲減模型基礎上，于孕10 d時每日以1.25 μg/100 g體質量劑量持續泵入L-T4，使孕10 d后血清TSH水平正常。

亞甲減治療B組(n=25)：在亞臨床甲減模型基礎上，于孕13 d時每日以1.25 μg/100 g體質量劑量持續泵入L-T4，使孕13 d后血清TSH水平正常。

亞甲減治療C組(n=25)：在亞臨床甲減模型基礎上，于孕17 d時每日以1.25 μg/100 g體質量劑量持續泵入L-T4，使孕17 d后血清TSH水平正常。

將成功創建各模型的150只SPF級Wistar雌鼠按2∶1與正常雄鼠交配，把發現陰道栓的時間確定為妊娠0天，標記為E0。亞甲減組模型選其中25只孕鼠繼續以每日0.95 μg/100 g體質量劑量持續泵入L-T4至產后21 d，標記為P21；剩余100只孕鼠在妊娠第10、13、17天開始以每日1.25μg/100 g體質量劑量持續泵入L-T4至產后21 d，分別標記為E10、E13、E17。

1.3 孕期母鼠妊娠血清指標檢測

所有模型母鼠孕前、E10、E13、E17抽取眶后靜脈叢血，測定孕鼠血清中TSH、TT4水平含量。在孕鼠孕后標記存活仔鼠數，出生第3天時擇優選取16只，并于出生第3、7、40天(分別標記為P3、P7、P40)時對仔鼠稱其質量，并檢測與腦發育的相關指標。

采用酶聯免疫法測定孕鼠血清TSH、TT4水平含量；采用Nissl染色法觀察大腦皮質和海馬形態學變化；采用Morris水迷宮實驗法檢測仔鼠學習記憶能力。

1.4 統計方法

2 結果

2.1 孕期母鼠血清TSH、TT4水平比較

結果見表1、圖1和圖2。各孕齡甲減組孕期母鼠血清TSH明顯高于同時間對照組(P<0.05)；亞甲減組孕前及E10時孕期母鼠血清TSH水平高于同時間對照組(P<0.05)；亞甲減治療B組、C組E13時孕期母鼠血清TSH水平高于同時間對照組(P<0.05)，且亞甲減治療C組E17時孕期母鼠血清TSH水平高于同時間對照組(P<0.05)。各孕齡對照組、甲減組、亞甲減組孕期母鼠血清TT4水平無差異(P>0.05)。

表1 孕期母鼠血清TSH、TT4水平比較Table 1 Comparison of serum TSH and TT4 levels in pregnant mothers

圖1 不同組別血清TSH水平變化Fig.1 Changes of serum TSH levels in different groups

圖2 不同組別血清TT4水平變化Fig.2 Changes of serum TT4 levels in different groups

2.2 發育期各組仔鼠的體質量水平比較

結果見圖3～圖5。P3、P7時亞甲減組仔鼠體質量低于對照組(P<0.05)；P7、P40時甲減組仔鼠體質量明顯低于對照組(P<0.05)。P3時甲減組仔鼠體質量低于亞甲減組(P<0.05)；P7時甲減組仔鼠體質量顯著低于亞甲減治療A組、B組(P<0.05)；P40時甲減組仔鼠體質量低于亞甲減治療B組、C組(P<0.05)。

2.3 不同組別仔鼠逃避潛伏期時間變化

在Morris水迷宮實驗中，如圖6所示，亞甲減治療A、B組仔鼠在各時間段逃避潛伏時間與對照組相比無明顯差別(P>0.05)，但亞甲減治療C組在各時間段逃避潛伏時間與對照組相比明顯延長(P<0.05)。

圖3 出生第3天(P3)注:與對照組比較，aP<0.05；與臨床甲減組比較，bP<0.05Fig.3 Day 3 of birth (P3)Note: compared with control group, aP<0.05; compared with clinical hypothyroidism,bP<0.05

圖4 出生第7天(P7)Fig.4 Day 7 of birth (P7)

圖5 出生第40天(P40)Fig.5 Day 40 of birth (P40)

圖6 不同組別仔鼠逃避潛伏期時間變化Fig.6 Temporal variation of escape latencyin offspring of different groups

2.4 各組仔鼠皮質及海馬形態學變化

皮質形態學變化(圖7)：P7、P40時對照組與亞甲減治療A組、B組仔鼠皮質各層神經細胞排列整齊，有典型桶狀結構，界限清晰；亞甲減組、亞甲減治療C組與甲減組仔鼠皮質各層神經細胞排列紊亂，且錐體細胞較小。

圖7 各組仔鼠皮質形態學變化注:A:對照組；B:亞臨床甲減治療A組；C：亞臨床甲減治療B組；D：亞臨床甲減治療C組；E:亞臨床甲減組；F:甲減組Fig.7 Morphological changes of cortex in offspring of each groupNote:A:control group； B:Subclinical hypothyroidism treatment group A； C:Subclinical hypothyroidism treatment group B； D:Subclinical hypothyroidism treatment group C； E: Subclinical hypothyroidism group； F:Hypothyroidism group

海馬形態學變化(圖8)：P7、P40時對照組與亞甲減治療A、B組仔鼠海馬錐體神經細胞排列整齊，界限清晰，可見多層細胞；亞甲減組、亞甲減治療C組與甲減組仔鼠皮質各層神經細胞排列紊亂、稀疏，無明顯界限。

圖8 各組仔鼠海馬形態學變化注：A:對照組；B:亞臨床甲減治療A組；C：亞臨床甲減治療B組；D：亞臨床甲減治療C組；E:亞臨床甲減組；F:甲減組Fig.8 Morphological changes of hippocampus in offspring of each groupNote:A:control group； B:Subclinical hypothyroidism treatment group A； C:Subclinical hypothyroidism treatment group B； D:Subclinical hypothyroidism treatment group C； E: Subclinical hypothyroidism group； F:Hypothyroidism group

3 討論

TSH可促進甲狀腺分泌TH，而TH可促進胎兒大腦成熟發育。妊娠前期TH主要來源母體，妊娠12周胎兒自行分泌，但胎兒直至妊娠中期甲狀腺功能才完全建立，因此母體的TH對胎兒腦部發育至關重要[5-6]。而SCH是以血液中TSH水平升高、血清甲狀腺激素(FT3、FT4)正常為基本特征的內分泌代謝疾病[7-8]。SCH治療不及時極易轉化為典型甲減。目前，臨床應用甲狀腺素替代治療甲減方式較為普遍。研究發現[9-10]L-T4能降低SCH孕婦血清中促甲狀腺激素水平，對改善妊娠結局有積極意義。其用藥原則為每日注射最小劑量的L-T4，以便獲得最佳效果[11]。

本研究結果顯示各孕齡甲減組孕期母鼠血清TSH明顯高于同時間對照組(P<0.05)，亞甲減組孕前及E10時孕期母鼠血清TSH水平高于同時間對照組(P<0.05)；各孕齡對照組、甲減組、亞甲減組孕期母鼠血清TT4水平無差異(P>0.05)。與亞臨床甲減血清TSH、TT4改變相符合，說明模型建立成功。觀察仔鼠體質量變化發現P3、P7、P40時亞甲減組仔鼠體質量低于對照組(P<0.05)，其中P3時甲減組仔鼠體質量低于亞甲減組(P<0.05)；P7時甲減組仔鼠體質量顯著低于亞甲減治療A組、B組(P<0.05)；P40時甲減組仔鼠體質量低于亞甲減治療B組、C組(P<0.05)。與田利民等[12]關于左旋甲狀腺素替代治療對孕期亞臨床甲狀腺功能減退大鼠的影響一致，說明亞臨床甲減激素血清學發生改變，且對亞甲減組治療后可影響仔鼠體質量正常發育。Morris水迷宮實驗為一種空間辨別的學習記憶模型，其機制與海馬大腦皮質相關[13]。研究發現亞甲減治療A、B組仔鼠在各時間段逃避潛伏時間與對照組相比無明顯差別(P>0.05)，但亞甲減治療C組在各時間段逃避潛伏時間與對照組相比明顯延長(P<0.05)，說明亞甲減組仔鼠學習記憶能力受損。進一步觀察仔鼠皮質及海馬形態學變化發現：P7、P40時對照組與亞甲減治療A組、B組仔鼠皮質各層神經細胞排列整齊，有典型桶狀結構，界限清晰；亞甲減組、亞甲減治療C組與甲減組仔鼠皮質各層神經細胞排列紊亂，且錐體細胞較小；P7、P40時對照組與亞甲減治療A組、B組仔鼠海馬錐體神經細胞排列整齊，界限清晰，可見多層細胞；亞甲減組、亞甲減治療C組與甲減組仔鼠海馬錐體神經細胞排列紊亂、稀疏，無明顯界限，與康蘇婭和汪云[14]關于左旋甲狀腺素對亞臨床甲狀腺功能減退對子代神經發育的影響一致，表明亞臨床甲減導致仔鼠海馬與皮質神經細胞排列紊亂，可能與仔鼠學習記憶能力受損有關。若在E13前給予L-T4治療，可糾正神經細胞紊亂狀態，E17后對已經排列紊亂的神經細胞無作用。

綜上所述，亞臨床加減可明顯影響體質量正常發育，降低后代學習記憶能力，若在E13之前給予L-T4治療可逆轉該損害，改善妊娠不良結局。