安徽省克氏原螯蝦白斑綜合征病毒檢測及疾病分析

陳紅蓮 ，王永杰 ，張靜 ，鮑俊杰

（1.安徽省農業科學院水產研究所，安徽 合肥 230031；2.水產增養殖安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230031）

克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）肉質細嫩，深受消費者喜愛，在湖北、安徽、江蘇、浙江、湖南等十多個省（市）進行廣泛養殖。近3年稻蝦綜合種養發展勢頭迅猛，安徽省克氏原螯蝦養殖面積從2016年的46 700 hm2，迅速發展到2018年約133 300 hm2。據統計數據顯示，2018年全國克氏原螯蝦產量達13×105t，仍處于供不應求的狀態，稻蝦綜合種養發展空間巨大。

2006年，白斑綜合征首次在浙江舟山養殖克氏原螯蝦中爆發[1]。2007年，美國路易斯安那州184個螯蝦養殖場超過60%的螯蝦感染了白斑綜合征病毒（White spot syndromvirus,WSSV）[2]。近些年，WSSV在全國各地克氏原螯蝦中檢出[1,3,4-8]，患病蝦的死亡率可高達52%[3]，給該蝦的養殖業造成了巨大的經濟損失。目前，白斑綜合征尚無有效治療藥物，疫情一旦爆發，不可控制。該研究在安徽省合肥市、安慶市、滁州市和蕪湖市的池塘、水庫及稻田采集克氏原螯蝦進行WSSV檢測，對稻田的水環境，蝦的養殖密度、產量及疾病發生情況進行跟蹤調查，以期為稻田養殖克氏原螯蝦防控白斑綜合征提供參考。

1 材料和方法

1.1 克氏原螯蝦樣本采集

該研究在安徽省合肥市、安慶市、滁州市和蕪湖市6個魚塘、水庫采集野生的克氏原螯蝦、16個稻田采集養殖的克氏原螯蝦進行檢測，每個點采集30只蝦，體質量約10～20 g。活體帶回實驗室，及時采集蝦的鰓組織，1只蝦為1個樣本，放置-80℃冰箱冷凍保存備用。

1.2 WSSV套式PCR檢測

取適量克氏原螯蝦鰓組織進行研磨，用Qiagen DNeasy Blood&Tissue Kit提取DNA作為PCR擴增模板。對抽提的DNA樣本采用OIE的WSSV套式PCR方法進行擴增[9]。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳分析。

1.3 密度

首次養殖克氏原螯蝦的稻田，統計投放蝦苗的規格及數量。自繁蝦苗的稻田，調查上一年親蝦放養情況，成蝦、蝦苗的出售情況。

1.4 養殖水環境

9：00對采集克氏原螯蝦樣本的16個稻田離田梗60 cm，深40 cm處的水質進行檢測，采用美國手持式多參數水質測量儀YSI Proplus測量溶解氧、pH 值、水溫，用 HJ535—2009、GB7493—87方法分別檢測氨氮、亞硝酸鹽，每個稻田測定3個位點，計算平均值。觀察各稻田青苔、水草的生長情況。

1.5 克氏原螯蝦產量及發病情況

本研究的稻田均為稻蝦連作種養模式，一年養殖一茬蝦，4—5月捕蝦上市，6月開始種植水稻。統計蝦的銷售量，觀察蝦的發病情況，統計蝦的死亡量，計算病死率。

2 結果

2.1 克氏原螯蝦WSSV檢測

6個魚塘、水庫采集的180個野生克氏原螯蝦樣本，首輪WSSV PCR檢測全部陰性，第二輪PCR檢測陽性率為8.89%（表1）；16個稻田采集的480個養殖克氏原螯蝦樣本，首輪PCR檢測陽性率為45.83%，第二輪PCR檢測陽性率為98.13%。蝦中WSSV首輪PCR檢測陽性率≥50%的稻田有10個（表2）。

表1 魚塘、水庫野生克氏原螯蝦的采集地及WSSV PCR檢測結果

表2 稻田克氏原螯蝦的采集地及WSSV PCR檢測結果

2.2 密度

2、4號稻田首次養殖克氏原螯蝦，放養5~10 g規格的蝦苗1萬尾/667 m2。13號稻田為第二年養殖克氏原螯蝦，稻田自繁了大量小蝦苗，4月初農戶又放入5~10 g規格的蝦苗0.8萬尾/667 m2，蝦養殖密度很高。

其他稻田均養殖克氏原螯蝦多年，在上一年的7—9月投放30~40 g規格的親蝦10~20 kg/667 m2。4月，5號稻田因伊樂藻過多，蝦捕撈困難，6，7，8號稻田出售蝦較少，養殖密度高。其他9個稻田均在4—5月及時出售成品蝦及部分蝦苗，養殖密度合適。

2.3 養殖水環境

16個稻田水中亞硝酸鹽數值均很低（數據未顯示），氨氮數值為正常范圍。5號稻田水中pH值偏高，平均值為9.17，水中溶解氧過飽和，平均值為9.04 mg/L。6號稻田水中溶解氧過飽和，平均值為13.56 mg/L。其他稻田pH值、溶解氧均處于正常范圍（表3）。5號稻田的伊樂藻占比達95%，6號稻田60%面積長了大量青苔。

2.4 克氏原螯蝦產量及發病情況

16個稻田累計出售克氏原螯蝦均在180 kg/667 m2以下。所有稻田養殖蝦均出現不同程度死亡，其中7，8號稻田蝦的病死率為20%，5，6，13號稻田蝦的病死率高，分別為50%、60%、70%，其他稻田蝦的病死率為10%及以下（表4）。部分2，4號稻田購買的蝦苗和6號稻田養殖的蝦有尾部起包癥狀，比例分別為 20%，20%，80%。從 5，7，8和13號稻田患病蝦的肝胰腺，6號稻田患病蝦的肝胰腺和尾部包塊內容物分離培養出大量細菌（數據未顯示）。

表3 稻田水質檢測

表4 稻田克氏原螯蝦養殖史、產量及發病情況

3 討論

該研究使用OIE的套式PCR方法檢測WSSV，靈敏度可達20個病毒粒子[9]，在疾病流行季節運用該方法進行檢測，能很好地反應克氏原螯蝦攜帶WSSV的狀況。經檢測發現安徽省4個市野生的比稻田養殖的克氏原螯蝦攜帶WSSV率低很多，分別為8.89%、98.13%，表明野生的比養殖的蝦更適合作為親本進行繁殖，獲得帶毒率更低的后代，同時也說明了亟需加強稻田養殖克氏原螯蝦白斑綜合征的防控研究工作。

稻田養殖克氏原螯蝦一般采取自繁自養方式進行，該蝦的繁殖期長（4—10月），主要集中在5月和9月下旬到10月中旬[10-12]，導致稻田中蝦的規格不整齊，大量小蝦苗給養殖密度評估及控制帶來困難。4—5月水溫適宜，蝦生長速度快[13-14]，容易出現高密度養殖狀態，因此，需要采取輪捕的方式將養蝦多年的稻田中大規格蝦捕撈上市，及時出售過多的蝦苗，控制蝦密度在適宜范圍內。

該研究中16個稻田養殖的克氏原螯蝦均攜帶WSSV，但各稻田蝦體內病毒復制的情況不同。特別是首輪WSSV PCR檢測陽性率≥50%的10個稻田，不同的養殖管理導致蝦病死率差異很大。其中2，4，14，15，16 號稻田蝦病死率≤10%。14，15，16號稻田養蝦多年，4—5月輪捕成品蝦及部分蝦苗上市，蝦養殖密度合理，水質良好，蝦的死亡率為5%。2和4號稻田首次養蝦，放養密度合理，盡管買進的蝦苗20%出現了尾部起包的癥狀，但在用碘制劑消毒養殖水體，管理好養殖水質的情況下，只出現不超過10%的病死率。而5、6、7、8和13號稻田，蝦死亡率為20%及以上。這些稻田，4月捕撈蝦少，出現高密度養殖狀態。特別是13號稻田，自繁了大量小蝦苗，4月初又放入蝦苗0.8萬尾/667 m2，超高養殖密度導致蝦的病死率高達70%。因此，推斷密度是決定攜帶大量WSSV的克氏原螯蝦病死率高低的關鍵因素之一。周俊芳等[15]在對對蝦（約8 g，42%攜帶WSSV）進行試驗時，發現高密度組（80尾/150 L玻纖桶）蝦的病死率（96.9%，鹽度恒定；98.1%，鹽度突降），比低密度組（30尾/150 L玻纖桶）蝦的病死率（5.0%，鹽度恒定為2%±0.1%；26.7%，鹽度突降至0.95%±0.05%）高得多，且高密度比鹽度突變更容易造成蝦死亡。

4—5月水溫（20~28℃）適宜 WSSV 復制[17]，高密度養殖導致克氏原螯蝦免疫力下降[16]，蝦體內病毒復制速度加快。WSSV抗逆性不強，制備好的病毒懸液置于29~31℃5~6 h即喪失活性[3]，據此推測稻田中患白斑綜合征的蝦死亡一段時間后，病毒部分或全部失活。然而，克氏原螯蝦有同類相互殘食習性[18]，高密度養殖條件下，蝦殘食加劇[19]，患白斑綜合征的蝦更容易在垂死或換殼時被其他蝦分食，使蝦群體帶毒率和帶毒量均增加，蝦的免疫力進一步下降，容易繼發細菌感染。該研究5，6，7，8和13號稻田高密度養殖患病蝦的肝胰腺中均分離到大量細菌。因此，4—5月高密度養殖攜帶WSSV的克氏原螯蝦，容易出現大量死亡。

pH值、氨氮、溶解氧、亞硝酸鹽等一直被研究者及養殖戶認為是影響克氏原螯蝦健康的重要水質因子[16，20]。晴天時，光合作用強，過多的伊樂藻導致5號稻田水中pH值偏高，溶解氧過飽和，大量的青苔使6號稻田水中溶解氧過飽和。雨天時，因為植物的呼吸作用，這些稻田水中的溶解氧將會被大量消耗，處于缺氧狀態。這些水質的異常變化降低了蝦的免疫力，增加蝦的病死率。21℃時淡水水體溶解氧的飽和度約為8.8 mg/L[21]，6號稻田上午9 h水中溶解氧飽和度已達154%，其水中溶解氧將隨光照時間增加而不斷增加，推測蝦尾部起包與溶解氧過飽和相關。龍蝦（Homarus americanus）曾被報道因其孵化場供水裝置空氣泄漏導致孵化場水體氣體過飽和，患了氣泡病[22]。鰱、鳙和鳊能承受的極限溶解氧飽和度約為120%，草魚和鯽能承受的極限溶解氧飽和度約為130%或更高[21]。