Zn 2+濃度和藻密度對多刺裸腹溞生命表統計學參數的影響

張燕 ，張慶 ，席貽龍 ，黃亞 ，趙清清 ，蔣琦辰

（1.江蘇省淡水水產研究所，江蘇 南京 210017；2.安徽師范大學生命科學學院，安徽 蕪湖 241000）

隨著工業的發展和進步，經濟迅猛增長的同時也給環境造成一定的破壞，冶金電鍍等各種工業廢水的不合理排放所產生的重金屬進入河流和湖泊等地從而污染水體，對水生生物的生存和繁殖造成了很大的負面影響，并且通過食物鏈的富集作用給人類的健康造成了嚴重的威脅。鋅（Zinc）是我們日常除了鐵、鋁及銅之外最常見的金屬，是生物體所必需的微量元素之一，是許多重要的酶的金屬輔基，細胞中許多生物蛋白質的結構和功能依靠鋅來維持著，例如，許多轉錄因子和DNA修復蛋白的功能區是鋅指蛋白[1-2]，對于維持生物體中的一些決定性的新陳代謝具有非常重要作用。如果攝入過多、不足、不平衡或缺乏，都將導致機體不同程度地出現異常或發生不同程度的疾病，高濃度的鋅會影響大多數以水環境為棲息地包括浮游動物在內的水生動物的生存和繁殖[2-3]，因此研究鋅對于水生浮游生物的影響具有重要的意義。

在淡水生態系統中，浮游動物的主要食物來源是浮游藻類，它們又是食物鏈中較高營養級生物的捕食目標，因此，在淡水生態系統的食物鏈和食物網中浮游動物起著重要的呈遞作用[4]。枝角類是淡水浮游動物的重要組成類群之一；多刺裸腹溞（Moina macrocopa）分布范圍廣泛、繁殖速度快、適應能力強，是易于進行人工培養的小型淡水枝角類[5]，在淡水生態系統的結構、功能和物質生產力的研究中具有非常重要的意義[6]。由于其較快的生長時間、較短的生命周期和能相對快速的對環境的改變做出反應，多刺裸腹溞被認為是水環境指示生物和毒性測試的受試生物[7]。曾有人做過關于 Cu、Cd、Pb[8-9]對多刺裸腹溞的影響試驗，但迄今為止，關于鋅對多刺裸腹溞的存活率以及繁殖率等的影響未見報道。

該文以淡水水體中常見的多刺裸腹溞作為受試生物，研究了在3種不同的斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）食物密度下不同的Zn2+濃度對多刺裸腹溞生命表統計學參數的影響，意在分析重金屬污染物毒性與食物供應之間的內在關聯，以得出多刺裸腹溞對水體環境中Zn2+污染物的敏感程度，為篩選出更好的監測水體污染物Zn2+的敏感性指標。

1 材料與方法

1.1 多刺裸腹溞的來源與培養

受試生物是由香港科技大學饋贈的多刺裸腹溞，實驗室內的培養液是由曝氣自來水（pH值7.0）與培養濾液組成的混合液（1∶1體積比），由HB-4培養基[7]培養的、處于指數增長期的斜生柵藻作為該次試驗所用的餌料[3]，高速離心濃縮后經過顯微計數使用[10]。實驗開始之前，在（25±1）℃、進行自然光照的恒溫培養箱內將多刺裸腹溞進行預培養到F3代。期間，每天更換一次一半的多刺裸腹溞培養液，并投喂密度分別為 0.5×106、1.0×106和 2.0×106cells/mL的斜生柵藻。

1.2 測試液的配置

試驗用氯化鋅（ZnCl2）來自上海化學試劑總廠，分析純（純度≥98.0%），化合物中Zn2+含量是實際使用的重金屬量。按照母液稀釋法配置測試溶液，進行實驗之前，先用蒸餾水將氯化鋅配制成10 g/L的原液，再用蒸餾水將原液稀釋成100 mg/L的母液，放置在溫度為4℃冰箱中備用，母液每隔3 d進行一次配制。試驗過程中用培養液將母液配制成所需濃度的測試溶液。

1.3 急性毒性試驗

為了找到適當的毒物濃度用開展進行生命表慢性毒性試驗，預先需要進行為期48 h的急性毒性實驗。根據正式試驗前的預試驗結果，把Zn2+濃度設定為 0、1.8、2.4、3.2、4.2、5.6 和 7.5 mg/L 共 6 個濃度梯度，其中0 mg/L是空白對照組；根據水生生物毒性檢測國家標準（GB/T16310.1—1996），從齡長在12 h內的多刺裸腹溞幼體中隨機選取10只試驗體放入50 mL玻璃燒杯中，加入50 mL測試液，進行急性毒性預試驗，每組均設置3個重復。試驗在（25±1）℃、恒溫暗室培養箱中進行，在24 h和48 h后進行觀察并記錄所有燒杯中多刺裸腹溞的存活個體數，以晃動燒杯15 s后多刺裸腹溞不運動為急性毒性試驗的死亡標準[3]，得到Zn2+對多刺裸腹溞的最小全致死濃度分別為：0.5×106cells/mL斜生柵藻下為3 mg/L，1.0×106cells/mL 下為 5 mg/L，2.0×106cells/mL下為4.5 mg/L。在預試驗基礎上再設置0.54、0.72、0.96、1.28、1.68 和 2.24 mg/L 共 6 個 Zn2+濃度組，另外建立一個空白對照組，每組設置3個重復。以相同的方式進行試驗，并且選擇使用概率單位法獲得48h-LC50值。

1.4 生命表試驗

依據急性毒性試驗得出的LC50值，將Zn2+濃度設置為 0（空白對照）、20.0、50.0、80.0、110.0 和140.0μg/L，總共6個Zn2+濃度組，實驗中斜生柵藻的密度設置為 0.5×106、1.0×106和 2.0×106cells/mL。隨機將齡長在12 h內的多刺裸腹溞幼體挑出作為實驗母體放入50 mL的玻璃燒杯中，并且添加50 mL測試液（其中分別含有相應濃度的Zn2+和相應密度的斜生柵藻）。每個濃度組設置3個重復，每個重復里面均放入10只多刺裸腹溞幼體。試驗在（25±1）℃、恒溫暗室培養箱中進行。在進行試驗的整個周期內，每24 h觀察并記錄每個燒杯中的母體存活數和新生的幼體數目，將燒杯中相對應Zn2+濃度和的相應藻類食物密度的測試液更換1次，并且進行試驗直到所有母體全部死亡。

1.5 相關參數的定義和計算

生命表統計學參數主要有：特定年齡繁殖率（mx）、生命期望（e0）、特定年齡存活率（lx）、世代時間（T）、內稟增長率（rm）和凈生殖率（R0）。

特定年齡繁殖率（mx）：表示的是X年齡組每個多刺裸腹溞個體平均所產的雌性后代數；生命期望（e0）：表示出生后的多刺裸腹溞個體平均能存活時長的估算值；特定年齡存活率（lx）：是指X年齡組的多刺裸腹溞開始時存活個體的百分比；世代時間（T）：多刺裸腹溞從親代出生到子代出生所經歷的時間，T=Σlxmxx/R0；內稟增長率（rm）：是在特定試驗條件下多刺裸腹溞種群的最大增長率；rm的精確值是在根據方程rm=ln R0/T估算的基礎上，根據方程在計算機中運算求得[6]；凈生殖率（R0）：指的是多刺裸腹溞種群經過一個世代后的凈增長率，R0=Σlxmx。

1.6 數據的統計與分析

采用SPSS 20.0軟件和Office軟件對各個生命表統計學參數進行數據的統計和分析。對試驗獲得的各個參數數據進行正態分布檢驗，將與正態分布相符的數據采用單因素方差分析、雙因素方差分析和LSD多重比較，分析各Zn2+濃度組間以及各食物密度組間的差異顯著性。各組多刺裸腹溞的平均存活時間利用生存分析中的Kaplan-Meier模型進行計算，并且對多刺裸腹溞在各測試組和對照組間存活時間的差異顯著性進行分析。

2 結果與分析

2.1 Zn2+對多刺裸腹溞的急性毒性

急性毒性試驗結果顯示，在（25±1）℃、沒有光照的條件下，多刺裸腹溞的病死率與Zn2+濃度間存在顯著的劑量-效應關系。Zn2+對多刺裸腹溞的48 h LC50值：0.5×106cells/mL 下為 1.096 mg/L，95%置信區間為 0.953～1.245 mg/L；1.0×106cells/mL 下為1.893 mg/L，95%置信區間為 1.683～2.120 mg/L；2.0×106cells/mL下為1.784 mg/L，95%置信區間為1.605～1.979 mg/L。

2.2 Zn2+濃度和食物密度對多刺裸腹溞的生存和繁殖的影響

試驗結果表明，Zn2+濃度和食物密度對多刺裸腹溞的存活率和生殖率都沒有顯著性影響（P＞0.05）（圖1）。

2.3 Zn2+濃度和食物密度對多刺裸腹溞各生命表統計學參數的影響

在3種食物密度下，生命表統計學參數顯示：Zn2+濃度對多刺裸腹溞的出生時的各個主要的生命表參數的顯著的影響（P＜0.05）程度不明顯。方差分析結果表明，通過與各個食物密度下的對照組進行比較，0.5×106cells/mL食物密度下，140μg/L的Zn2+對多刺裸腹溞的生命期望具有顯著影響（P＜0.05）；1.0×106cells/mL食物密度下，50μg/L的Zn2+對多刺裸腹溞的內稟增長率有顯著的影響（P＜0.05）。2.0×106cells/mL食物密度下，80μg/L的Zn2+顯著降低了其內稟增長率（表1）。雙因素方差分析結果表明，Zn2+濃度對多刺裸腹溞的種群內稟增長率有極顯著影響（P＜0.01），藻密度對多刺裸腹溞的世代時間有顯著影響（P＜0.05），藻密度對多刺裸腹溞的凈生殖率和種群內稟增長率均有極顯著影響（P＜0.01）。藻類食物密度和Zn2+濃度之間的交叉互作作用對多刺裸腹溞的各生命表統計學參數均無顯著影響（P＞0.05）（表2）。多重比較結果顯示，3種食物密度間，多刺裸腹溞的世代時間在1.0×106cells/mL食物密度下顯著短于0.5×106和2.0×106cells/mL食物密度下；凈生殖率和種群內稟增長率均在1.0×106cells/mL食物密度下最高，2.0×106cells/mL食物密度下最低。50.0和80.0μg/L的Zn2+使多刺裸腹溞的種群內稟增長率顯著高于對照組和其它各Zn2+濃度組。

表1 三種食物密度（×106 cells/mL）下不同濃度的Zn2+對多刺裸腹溞出生時的生命期望、世代時間、凈生殖率、種群內稟增長率和平均壽命的影響

圖1 三種食物密度和不同Zn2+濃度下多刺裸腹溞的存活率和繁殖率

表2 食物密度和Zn2+濃度對多刺裸腹溞各主要生命表統計學參數影響的雙因素方差分析結果

2.4 Zn2+濃度與多刺裸腹溞各主要生命表統計學參數之間的關系

Zn2+濃度與多刺裸腹溞的生命表統計學參數中的生命期望和平均壽命在0.5×106cells/mL食物密度下存在著顯著的劑量-效應關系，可分別描述為：e0=-0.004x2+0.063x+348.604（R2=0.434,P＜0.05）和t=-0.025x2-0.507x+84.468（R2=0.434,P＜0.05）。

3 討論

3.1 重金屬污染物的相對毒性

隨著工業的發展，湖泊水體受到各種重金屬的污染已經日益嚴重[11]，而重金屬具有的難以降解、在生物體內富集和具有毒性大等特點，對生活在其中的生物具有直接的毒害作用。劉昔等[8]分析表明在湖泊水體中廣泛存在的六種重金屬離子濃度由高到低依次為 Zn、Pb、Cr、Cu、Cd、Hg。已有研究表明 25 ℃，1.0×106cells/mL 藻密度下，Cu2+和 Cd2+對多刺裸腹溞的48 h LC50值分別為0.106 mg/L和0.117 mg/L[9]，可見，Zn2+對多刺裸腹溞毒性相比較Cu2+和Cd2+小。另有研究表明，1.0×106cells/mL藻密度下，Pb2+對隆線溞（Daphnia carinata）、模糊網紋溞（Ceriodaphnia dubia）、蚤狀溞（Daphnia pulex）的 48h-LC50值分別為 0.4 mg/L[12]、20.9 mg/L[12]、0.050 mg/L[6，13]；這表明對Pb2+的敏感性，多刺裸腹溞比模糊網紋溞更強，但又比隆線溞和蚤狀溞等溞類弱。本研究結果表明，多刺裸腹溞對Zn2+具有一定的敏感性，但是這種敏感性在一定的食物密度下會被降低，枝角類對Zn2+的相對毒性相對于其他重金屬而言較弱。

3.2 食物密度和Zn2+濃度對枝角類繁殖的影響

較低或較高濃度的食物密度對枝角類的繁殖有顯著影響，大型溞（Daphnia magna）、多刺裸腹溞、短腹平直溞（Pleuroxus aduncus）、角突網紋溞（Ceriodaphnia cornuta）和老年低額溞（Simocephalus vetuloides）等枝角類的繁殖率顯著降低[14]。該試驗結果與之類似，多刺裸腹溞的凈生殖率在2.0×106cells/mL食物密度下最低，1.0×106cells/mL食物密度下最高。

大多數污染物都有不利于枝角類的繁殖，如Pb2+污染降低了多刺裸腹溞的繁殖率[6]。有研究表明，Zn2+具有環境雌激素的特性[11]，25.0μg/L的Zn2+能夠顯著地增加了發頭裸腹溞（Moina irrasa）前兩窩的懷卵數[12]。該研究中，Zn2+濃度對多刺裸腹溞的繁殖率的影響不顯著；Zn2+濃度和藻密度對枝角類的相關生命表中各統計參數均無顯著交叉互作作用，Zn2+濃度對枝角類的毒性作用受到食物濃度的影響在一定的范圍內變化較小，這可能是由于Zn2+本身是生物體所需的微量元素之一，參與生物體本身的多種生命活動過程，所以對于枝角類的毒性作用不是很明顯。

研究表明，食物濃度的提高通常能夠顯著提高枝角類的繁殖率[15]。過高或過低的食物密度對多刺裸腹溞抵御外界環境變化具有不利的影響，而當動物可獲得的食物保持在中等水平時，能量的代謝與需求會在很大的程度上提高多刺裸腹溞抵御外界環境的能力。該研究結果中，當食物密度從0.5×106cells/mL 升高為 1.0×106cells/mL 時，Zn2+濃度對多刺裸腹溞的繁殖率的影響有一定的消減作用，而當食物密度升高至2.0×106cells/mL時，Zn2+又對多刺裸腹溞的繁殖率的產生了不利的影響。

3.3 食物密度和Zn2+濃度對枝角類種群增長的影響

當蛋白核小球藻（Chlorella vulgaris）的密度升高時，NH4Cl對網紋溞、多刺裸腹溞和蚤狀溞、Zn2+對網紋溞和蚤狀溞等種群增長的遏制作用強度會逐漸下降，主要原因是一定程度上食物密度的增加能夠降低不利的環境因素對浮游動物的毒性[3，13，16-18]。然而，該研究中，每種食物密度下的Zn2+濃度多刺裸腹溞的種群內稟增長率都沒有顯著的影響；這可能由于多刺裸腹溞對食物資源的耐受性比較強，所以在同一種食物密度下，不同的濃度的Zn2+對多刺裸腹溞的毒性作用的影響不顯著。但當忽略食物密度的影響時，50.0和80.0μg/L的Zn2+濃度對多刺裸腹溞的種群內稟增長率的影響顯著高于對照組和其它各Zn2+濃度組，表現出顯著的促進種群增長的效果。