三七總皂苷誘導(dǎo)下的肝癌細(xì)胞Hep G2細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序分析

申文豪，楊 頌，姜 敏，張 瑋

（泰州市人民醫(yī)院，江蘇 泰州 225300）

雖然肝癌的新增發(fā)病率逐年下降，2019年全世界新增腫瘤發(fā)病率排名中已跌出前十，但其腫瘤死亡病例的占比仍高居第5位[1]。由于地域性經(jīng)濟(jì)的差距，導(dǎo)致各地醫(yī)療水平和人們重視程度不同，很多人在確診時就已處于腫瘤晚期。進(jìn)行肝癌治療時，患者多采用綜合治療原則，早期應(yīng)用手術(shù)或者肝移植，中晚期應(yīng)用動脈栓塞、局部消融、放療、化療及生物分子靶向治療等措施。中藥三七提取物三七總皂苷具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡等作用，我們的前期研究也發(fā)現(xiàn)其具有化療增敏和放療增敏的作用，但其作用機(jī)制尚不明確[2,3]。本研究以肝癌細(xì)胞株HepG2為研究對象，采用基因芯片檢測技術(shù)，探討三七總皂苷誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2的基因表達(dá)譜的變化，篩選差異表達(dá)的基因，并進(jìn)行差異表達(dá)基因功能分析，以期為研究三七總皂苷的抗腫瘤機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑三七總皂苷（成都貝斯特試劑有限公司）；二甲基亞砜（DMSO，Sigma公司）；胎牛血清、高糖培養(yǎng)基（HyClone公司）；Trizol試劑（Invitrogen公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)肝癌HepG2細(xì)胞（中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫），培養(yǎng)于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，每3d～4d傳代一次。取對數(shù)增殖期細(xì)胞進(jìn)行實驗，傳代次數(shù)＜20次。

1.3 基因芯片200微摩爾/升三七總皂苷處理HepG2細(xì)胞，同樣體積的DMSO處理同時細(xì)胞作為對照組，48小時后，采用Trizol試劑提取總RNA。由基爾頓生物科技（上海）有限公司采用Illumina TruseqTMRNA sample prep Kit方法進(jìn)行文庫構(gòu)建、測序。

1.4 差異表達(dá)基因及功能富集分析采用Audic S

算法進(jìn)行差異表達(dá)基因分析，將錯誤發(fā)現(xiàn)率（Falsediscovery rate，F(xiàn)DR）校正后的FDR＜0.05且差異倍數(shù)|log2FC|≥1的視為差異表達(dá)基因，并對篩選得到的差異表達(dá)基因進(jìn)行聚類分析。利用GO數(shù)據(jù)庫對差異表達(dá)的基因進(jìn)行GO信號通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序與差異表達(dá)基因分析轉(zhuǎn)錄組測序得到對照組和處理組總的reads數(shù)分別有64025270和64179790條，過濾得到clean reads數(shù)所占比例分別為96.8%和96.7%，共檢測到58233個基因，有統(tǒng)計學(xué)差異表達(dá)基因77個，其中上調(diào)的基因30個，下調(diào)的基因47個，聚類圖（1A）和火山圖（1B）見圖1。

圖1 差異表達(dá)基因聚類圖（1A）和火山圖（1B）

2.2 差異表達(dá)基因GO分類統(tǒng)計利用GO數(shù)據(jù)庫（Gene Ontology，http：//www.geneontology.org/），將基因按照它們參與的生物學(xué)過程（Biological Process，BP）、構(gòu)成細(xì)胞的組分（Cellular Compo?nent，CC）和實現(xiàn)的分子功能（Molecular Func?tion，MF）進(jìn)行分類。對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO分類統(tǒng)計，并將所得結(jié)果繪制上、下調(diào)基因GO注釋柱形圖（圖2）。

圖2 差異表達(dá)基因GO注釋柱形圖

2.3 差異表達(dá)基因GO富集分析利用GO數(shù)據(jù)庫，對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能顯著性富集分析，使用軟件：Goatools（https：//github.com/tanghai?bao/GOatools），使用方法為Fisher精確檢驗，為控制計算的假陽性率，使用4種多重檢驗方法（Bon?ferroni，Holm，Sidak和false discovery rate）（West?fall和Stanleyyoung，1989）對P值進(jìn)行了校正，經(jīng)過校正的P值≤0.05時，認(rèn)為此GO功能存在顯著富集情況。見圖3。

圖3 差異表達(dá)基因GO富集柱狀圖

2.4 顯著富集GO的層級結(jié)構(gòu)展示通過對GO富集分析產(chǎn)生的GO主題進(jìn)行可視化分析，發(fā)現(xiàn)三七總皂苷在多個方面產(chǎn)生影響，主要為分子功能：小分子、核苷酸磷酸化分子，核苷酸分子，黃素腺嘌呤二核苷酸分子；生物過程中的高爾基體功能相關(guān)；高爾基體囊泡介導(dǎo)轉(zhuǎn)運、高爾基體內(nèi)囊泡循環(huán)逆行轉(zhuǎn)運、定位高爾基體的蛋白；細(xì)胞組分：細(xì)胞質(zhì)等方面存在顯著差異性，見圖4。

圖4 差異表達(dá)基因的顯著性GO有向無環(huán)圖

3 討論

本研究共發(fā)現(xiàn)三七總皂苷處理肝癌HepG2細(xì)胞后異常表達(dá)的基因77個，其中56個基因與GO Term中的41個主題相關(guān)，分別是25個上調(diào)的基因和31個下調(diào)的基因。相關(guān)主題占比超過50%的基因有7個，分別為ARPC4-TTLL3、RBM4、MYBPC1、

ATP6V1B1、NUPR1、PLB1、XXbac-BPG32J3.22，它們分別至少同21個主題相關(guān)。其中研究較多的與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因為上調(diào)基因中的RBM4、下調(diào)基因中的NUPR1。

RBM4是RNA結(jié)合蛋白，具有抑制腫瘤生長的作用，可以通過調(diào)節(jié)靶基因前體mRNA的可變剪接發(fā)揮抑制作用。RBM4通過促進(jìn)雌激素受體α（ERα）的泛素化降解下調(diào)ERα的表達(dá)，發(fā)揮抑制乳腺癌的作用[4]。更多資料顯示，RBM4可以抑制肺癌H157細(xì)胞、卵巢癌SKOV3細(xì)胞、胰腺癌Panc-1細(xì)胞、肝癌HepG2細(xì)胞及前列腺PC-3細(xì)胞的生長[5]。RBM4通過抑制SRSF1的表達(dá)，降低致癌基因S6K1和4E-BP1的磷酸化激活，抑制mTOR通路[5]。大量臨床數(shù)據(jù)顯示，非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌和胰腺癌的腫瘤組織中表達(dá)的RBM4比癌旁正常組織中的低[6-8]。KM plotter數(shù)據(jù)庫分析RBM4和腫瘤患者生存率之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)RBM4的高表達(dá)與肺癌、乳腺癌和卵巢癌總體生存率的上升有相關(guān)性，可能是影響腫瘤患者生存率的獨立預(yù)后因素[5]。

NUPR1蛋白是一種定位于細(xì)胞核的小分子蛋白，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，能夠促進(jìn)乳腺癌、胰腺癌、甲狀腺癌、非小細(xì)胞肺癌等腫瘤的生長[9]。NUPR1蛋白及其mRNA在臨床收取的多種類型的腫瘤標(biāo)本中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。乳腺良性病變向乳腺癌前病變發(fā)展，最后發(fā)展為乳腺癌，NUPR1在其發(fā)展過程種逐漸增高，且其高表達(dá)與預(yù)后不良相關(guān)[9]。正常肝臟組織中無NUPR1的表達(dá)，肝癌的癌前病變，如肝炎和肝硬化中，NUPR1表達(dá)逐漸增高，肝癌樣本中表達(dá)最高。ZZW-115是一種NUPR1抑制劑，不僅能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和壞死抑制腫瘤細(xì)胞生長，而且能誘導(dǎo)線粒體衰竭導(dǎo)致細(xì)胞死亡[10]。

我們前期的研究顯示三七總皂苷抑制肝癌細(xì)胞的生長，提高其對順鉑和X射線的敏感性[2,3]，可能和三七總皂苷上調(diào)RBM4的表達(dá)、下調(diào)NU?PR1的表達(dá)相關(guān)。通過本次基因芯片檢測與分析，可以提出假設(shè)：三七總皂苷可以通過增加RBM4的表達(dá)，抑制mTOR通路，啟動細(xì)胞凋亡和壞死機(jī)制，抑制NUPR1的表達(dá)，通過線粒體衰竭誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用。

4 結(jié)論

肝癌發(fā)生發(fā)展過程涉及多個生物學(xué)過程和信號通路的改變。本研究分析了三七總皂苷對肝癌HepG2細(xì)胞的基因表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的基因77個，其中上調(diào)30個，下調(diào)47個。基因功能注釋結(jié)果表明三七總皂苷通過改變多個基因的表達(dá)，影響與腫瘤密切相關(guān)的生物學(xué)進(jìn)程和信號通路。在異常表達(dá)的基因中，RBM4和NUPR1是已知的與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的基因，可能與三七總皂苷調(diào)控肝癌的放療和化療敏感性存在一定的相關(guān)性。