白藜蘆醇調(diào)控Hedgehog信號通路抑制肝星狀細胞活化的研究

周薏， 闕任燁， 李勇， 朱樑

（1.海軍軍醫(yī)大學附屬長征醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 200003；2.上海中醫(yī)藥大學附屬上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院脾胃病科，上海 200082）

肝纖維化是肝硬化發(fā)病的重要環(huán)節(jié)，迄今沒有滿意的治療方法。目前國內(nèi)外絕大多數(shù)學者認為，肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）激活是肝纖維化形成的關(guān)鍵，抑制HSC的激活對肝纖維化的防治具有重要價值[1]。有研究發(fā)現(xiàn)Hedgehog信號通路與HSC的活化密切相關(guān)，有效干預Hedgehog信號通路可抑制肝纖維化進展[2]。白藜蘆醇是存在于中藥藜蘆、虎杖中的一種多酚類化合物，具有廣泛的藥理作用，且無毒副作用及致癌性報道[3]，抗肝纖維化是白藜蘆醇的重要應用領(lǐng)域之一[4-6]。目前，關(guān)于白藜蘆醇抗肝纖維化的作用機制尚不完全明確，而又有多項研究[7-9]報道白藜蘆醇可調(diào)控Hedgehog信號通路發(fā)揮作用，故本研究旨在觀察白藜蘆醇抑制HSC-T6細胞活化的機制是否與調(diào)控Hedgehog信號通路有關(guān)，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞 大鼠肝星狀細胞株HSC-T6由上海第二軍醫(yī)大學長征醫(yī)院消化科惠贈，其表型為活化的HSC。

1.2 藥物、試劑與儀器 白藜蘆醇購于中國藥品生物制品檢定所，純度＞99%，批號：111535-201703；環(huán)耙明（cyclopamine）購自美國Cayman公司，批號：11321。α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）（兔抗大鼠IgG多克隆抗體）購自美國Santa Cruz公司，批號：k1814；電化學發(fā)光（ECL）試劑盒購自美國Millipore公司，批號：1115702；DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Thermo Scientific公司，批號：NZH1209；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自奧地利PAA公司，批號：A10106-0455；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）購自美國Amresco公司，批號：201705；蛋白質(zhì)分子量預染Marker購自美國Pierce公司，批號：27681；山羊抗兔HRP標記二抗購自美國Cell Signaling公司產(chǎn)品 ， 批 號 ： 8176； Shh、 Smo、 Patched、 Gli1、Cyclin D1、Cyclin D2、Bcl-2引物由生工生物公司合成；Trizol Reagent購自美國Sigma公司，批號：BCBN5665V；PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser購自日本Takara公司，批號：AK2301；SYBR?Green Realtime PCR Master Mix購自日本Takara公司，批號：AK5005。ChemiDocTMXRS+凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；酶標儀（美國Thermo Scientific公司）；PCR儀（美國Bio-Rad公司）。

1.3 細胞培養(yǎng)[10]與分組 HSC-T6細胞用含有體積分數(shù)10%熱滅活胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基在37℃、體積分數(shù)5%CO2、完全飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)，每48 h更換培養(yǎng)基，細胞生長鋪滿培養(yǎng)瓶底80%后，用0.25%胰蛋白酶聯(lián)合0.02%EDTA消化傳代。實驗選用處于對數(shù)生長期細胞，將細胞接種于合適的細胞板中進行培養(yǎng)，24 h后進行干預處理。白藜蘆醇組分別加入終濃度為4、8、16 μmol/L的白藜蘆醇，環(huán)耙明組加入終濃度為100 μmol/L的環(huán)耙明，空白組及模型組加入等量培養(yǎng)基溶液。預處理30 min后，模型組及各藥物處理組加入終濃度為100 ng/mL的瘦素誘導HSC-T6細胞活化，空白組加入等量培養(yǎng)基溶液。24 h后收集樣本進行相關(guān)檢測。

1.4 四甲基偶氮唑鹽（MTT）檢測細胞增殖情況[10]取對數(shù)生長期的大鼠HSC-T6細胞，常規(guī)消化、制備單細胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔1×104個/100 μL，另設(shè)細胞空白組及單純培養(yǎng)液本底組。細胞鋪板24 h后，每孔加入完全培養(yǎng)基配制的藥物，每個濃度設(shè)6個復孔，空白組加入等體積的三聯(lián)液。分別繼續(xù)培養(yǎng)24 h。加入5 mg/mL的MTT試劑，每孔10 μL，37℃孵育4 h。棄孔內(nèi)上清，加入二甲基亞砜（DMSO）溶劑，每孔150 μL。37℃恒溫搖床中震蕩10 min，使沉淀充分溶解后，置于酶標儀上測定490 nm波長的吸光度（OD）值，按以下公式計算細胞增殖率：細胞增殖率=（實驗組OD值-本底組OD值）/（空白組OD值-本底組OD值）×100%。

1.5 Western Blot檢測[11]將藥物處理后的細胞棄去培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細胞3次后，加入150 μL細胞裂解液（含蛋白酶抑制劑1∶100），置于搖床上30 min（冰上）。用細胞刮刀將細胞刮下后，將細胞懸液移入EP管內(nèi)，以12 000 r/min離心20 min，取上清。按照1∶4體積比加入5×loading buffer，100℃水浴10 min，使蛋白變性。分裝，于-20℃保存?zhèn)溆谩Ｅ渲剖榛蛩徕c（SDS）—聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）膠，分離膠的濃度為8%，積層膠為5%。上樣10 μL預染Marker，以確定所檢測蛋白帶的位置。初始電壓為80 V，溴酚藍電泳至積層膠和分離膠分界面后加大至120 V，至凝膠底部時停止電泳。將蛋白從SDS-PAGE膠上轉(zhuǎn)移至相同大小的NC膜上，轉(zhuǎn)膜條件為電壓100 V，90 min。使用50 g/L的脫脂奶粉封閉1～2 h后，加入按比例稀釋的一抗（α-SMA 1∶1 000，β-actin 1∶1 000），4℃過夜。使用TBST洗膜以后，加入二抗，即1∶1 000稀釋的山羊抗小鼠或兔抗體，室溫慢搖1 h。TBST洗膜后，在條帶上滴加100 μL的熒光液。使用ChemiDocTMXRS+凝膠成像分析系統(tǒng)進行半定量分析，以積分光密度（IOD）值表示，以目的蛋白/內(nèi)參蛋白表示目的蛋白的相對表達水平（p）。

1.6 RT-PCR方法[10]（1）提取總RNA：取6孔板培養(yǎng)的各組細胞，向每孔加入0.5 mL Trizol溶液，充分吹打。加入200 μL氯仿劇烈振蕩15 s，冰上靜置10 min。于4℃以12 000 r/min離心20 min，吸取上層液體，轉(zhuǎn)移到新的EP管中。加入等體積異丙醇，混勻，冰上靜置10 min，于4℃以12 000 r/min離心20 min。棄上清，沉淀體積分數(shù)75%乙醇洗滌2遍。常溫下以7 500 r/min離心5 min，棄上清，沉淀干燥然后用20 μL DEPC水溶解得到RNA原液，測各樣本RNA濃度。（2）兩步法實時逆轉(zhuǎn)錄PCR反應：①第1步逆轉(zhuǎn)錄：在無核酸酶的離心管中每個樣本加入總RNA 4 μg，5×PrimeScript RT Master Mix 2 μL，RNase free H2O補足至10 μL。反應條件：25℃10 min，42℃30 min，85℃10 min。cDNA將得到的樣品-20℃短期保存。②第2步PCR反應：各引物見表1。SyberGreen預混Taq酶10 μL，加上下游引物至總濃度10 μmol/L，加入第1步得到的cDNA模板5 μL（稀釋10倍后），以DEPC-dd H2O補足至20 μL，混勻，實時上機檢測。反應條件為95℃3 min預變性，95℃10 s變性，60℃30 s退火，同時收集熒光，40個循環(huán)。由軟件自動生成擴增曲線和熔解曲線判斷其擴增效率，根據(jù)目標基因與GAPDH擴增產(chǎn)物的2-△△CT比值來分析計算各目標基因相對表達量。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequence

1.7 統(tǒng)計方法 采用SPSS 23.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（）表示，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇對瘦素誘導的HSC-T6細胞增殖與活化的影響 圖1結(jié)果顯示：經(jīng)瘦素誘導后，HSCT6細胞增殖率明顯升高，活化表型α-SMA蛋白表達明顯增多，與空白組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；白藜蘆醇呈劑量依賴性抑制瘦素誘導HSC-T6細胞的增殖與活化，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，環(huán)耙明組亦具有顯著的抑制瘦素誘導的HSC-T6細胞增殖的作用（P＜0.01）。

圖1 白藜蘆醇對瘦素誘導HSC-T6細胞增殖與活化的影響Figure 1 The effects of resveratrol on the proliferation and activation of HSC-T6 cells induced by leptin

2.2 白藜蘆醇對活化的HSC-T6細胞中Hedgehog信號通路的影響 圖2結(jié)果顯示，經(jīng)瘦素誘導后，HSC-T6細胞內(nèi)Hedgehog信號通路成員Shh、Smo、Patched、Gli1 mRNA表達水平明顯升高，與空白組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；白藜蘆醇呈劑量依賴性抑制活化HSC-T6細胞內(nèi)Shh、Smo、Patched、Gli1 mRNA的表達，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；環(huán)耙明組與模型組比較亦具有顯著的抑制Shh、Smo、Patched、Gli1 mRNA表達的作用（P ＜0.01）。

2.3 白藜蘆醇對活化的HSC-T6細胞中Gli1靶基因表達的影響 圖3結(jié)果顯示：經(jīng)瘦素誘導后，HSC-T6細胞內(nèi)Gli1靶基因Bcl-2、Cyclin D1、Cyclin D2 mRNA表達明顯升高，與空白組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；白藜蘆醇呈劑量依賴性抑制活化HSC-T6細胞內(nèi)Gli1靶基因Shh、Smo、Patched、Gli1 mRNA的表達，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，環(huán)耙明組亦具有顯著的抑制HSC-T6細胞Bcl-2、Cyclin D1、Cyclin D2 mRNA表達的作用（P ＜ 0.01）。

3 討論

肝纖維化是肝硬化過程中一種可逆的病理改變。隨著肝纖維化病理機制研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)Hedgehog信號通路的活化與HSC細胞的激活密切相關(guān)，該通路可能是一個很有前途的藥物干預靶標[2，12-14]。

Hedgehog信號通路是主要的調(diào)節(jié)昆蟲和哺乳動物胚胎發(fā)育的經(jīng)典通路之一，其對細胞命運的決定是通過調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄因子Gli的表達來完成的。Hedgehog通路決定著胚胎干細胞的分化發(fā)育，HSC可能是定向分化的干細胞，在異常使動因素的作用下，向成纖維細胞轉(zhuǎn)變。Hedgehog信號通路在多種損傷組織的重塑中起重要作用，共同促進創(chuàng)傷的愈合[15-16]，如Shh能加速血管生成[17]、心臟修復[18]、神經(jīng)和皮膚再生[19]、骨骼重塑、定向造血干細胞的分化；而HSC的異常活化則是對受損的肝組織的修復。

圖2 白藜蘆醇對瘦素誘導的HSC-T6細胞中Hedgehog信號通路的影響Figure 2 The effects of resveratrol on Hedgehog signaling pathway in HSC-T6 cells induced by leptin

Hedgehog信號通路主要由信號分子Shh，膜受體Patched、Smoothened（Smo），一些中間傳遞分子和轉(zhuǎn)錄因子Glis組成。在無配體激活的情況下，Patched經(jīng)VitD3與Smo結(jié)合并抑制Smo的活性；當Hedgehog通路配體Shh與Patched結(jié)合后，就解除了對Smo的抑制，進而激活下游Gli家族轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄[20]。研究[21]表明，Hedgehog通路的大部分靶基因可以由Gli1轉(zhuǎn)錄激活，如調(diào)控細胞增殖、控制細胞命運的基因包括Cyclin D1、Cyclin D2、Bcl-2等。Bcl-2是第一個被確認具有抑制凋亡作用的Gli1下游靶基因，其高表達能阻抑多種凋亡誘導因素（如射線、化學藥物等）所引發(fā)的細胞凋亡[21-22]。Bcl-2的轉(zhuǎn)錄是由于Gli的鋅指結(jié)構(gòu)域與位于Bcl-2轉(zhuǎn)錄起始位點上游的Gli結(jié)合位點相互結(jié)合所引起的[21]。Zarnara等[23]的研究也證實了Bcl-2在維持人HSC的持續(xù)激活中發(fā)揮了重要作用。因此，提示Hedgehog通路可通過Gli介導Bcl-2，激活HSC。

在各種生理或病理狀態(tài)下，Hedgehog通路以旁分泌和自分泌的方式作用于Hedgehog敏感細胞。在慢性肝病的細胞微環(huán)境中，受損的肝細胞和活化的HSC大量分泌Hedgehog配體至胞外環(huán)境中，與Hedgehog敏感的HSC的相應受體結(jié)合，進而活化Hedgehog通路調(diào)控HSC的生物學行為[24]。研究[25-28]發(fā)現(xiàn)，多種活化的HSC均表達Hedgehog配體和 Hedgehog通路 Shh、Patch、Smo和 Gli等多重組分。另外，還有研究發(fā)現(xiàn)Hedgehog通路的激活是靜息性HSC（Q-HSC）轉(zhuǎn)變成肌成纖維樣HSC（MF-HSC）所需要的，尤其是可促進上皮到間質(zhì)轉(zhuǎn)換[29]；Hedgehog信號通路通過Gli調(diào)控相關(guān)靶基因，促進HSC不斷地活化[30]。用Hedgehog通路抑制劑—環(huán)耙明作用后，肝損傷明顯降低，并通過調(diào)節(jié)HSC激活后基因表達的改變，控制細胞的轉(zhuǎn)化，改善肝纖維化[31]。

圖3 白藜蘆醇對瘦素誘導HSC-T6細胞中Gli1靶基因的影響Figure 3 The effects of resveratrol on Gli1 target genes in HSC-T6 cells induced by leptin

中醫(yī)藥在抗肝纖維化方面具有獨特優(yōu)勢。大量的臨床實踐和實驗研究表明，一些中藥復方、單味中藥及中藥單體已經(jīng)被證實有抗纖維化作用，療效肯定，副作用少。白藜蘆醇具有顯著的抗氧化應激作用[32]，且在體內(nèi)外均具有明顯的抗肝纖維化作用[33]。但目前對其抗纖維化作用機制及靶點的仍不明確。有文獻[7-9]報道，白藜蘆醇能夠通過下調(diào)Hedgehog信號通路抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進而在治療胰腺癌轉(zhuǎn)移、腎纖維化、肺纖維化等疾病中發(fā)揮重要作用。故本研究將白藜蘆醇調(diào)控Hedgehog信號通路這一機制引入肝纖維化這一疾病進行實驗探索。本次研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能夠通過抑制Hedgehog信號通路活化及其下游靶基因表達，從而達到抑制HSC細胞激活的作用。由于Hedgehog信號通路參與細胞增殖、細胞凋亡、上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化等多種肝纖維化病理機制，我們推測其抑制纖維化作用可能是通過促進HSC凋亡，抑制上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化等途徑發(fā)揮其藥理作用，但仍需進一步實驗證實。本研究結(jié)果不僅對發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇新的藥理作用機制和作用靶點具有積極的作用，也為中藥新藥的開發(fā)提供了一定的實驗依據(jù)，可為白藜蘆醇臨床應用于治療各種急慢性肝臟疾病提供一定的理論支持。